骨肽對成骨細胞骨形成蛋白2表達影響的實驗研究

崔曉明 韓 斌

成骨細胞增殖與分化是骨折愈合的關(guān)鍵步驟，成骨細胞數(shù)目增加、細胞外基質(zhì)成熟和礦化，可以填補骨缺損并促進骨折愈合。骨肽能夠調(diào)節(jié)骨代謝，并具有刺激成骨細胞增殖、促進新骨形成等藥理作用，目前廣泛應(yīng)用于骨折愈合、骨代謝疾病、風(fēng)濕及類分濕性關(guān)節(jié)炎的修復(fù)治療［1］。本研究體外分離培養(yǎng)成骨細胞，觀察骨肽對成骨細胞的增殖作用，并檢測其骨形成蛋白2(BMP2)表達的影響，為骨肽的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:Wistar乳鼠購自吉林大學(xué)動物實驗中心。

1.1.2 主要試劑:DMEM－H培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司);骨肽(安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司);FACScan流式細胞儀(美國BeckmanCou lter公司);BMP2酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢新啟迪生物科技有限公司);全自動酶標(biāo)儀(英國BMG Labtech公司)。

1.2 方法

1.2.1 顱蓋骨分離成骨細胞:取2～3天齡乳鼠20只，處死后75%酒精浸泡2分鐘，無菌手術(shù)分離顱蓋骨，無菌PBS液清洗2～3次，將顱蓋骨至于無血清DMEM培養(yǎng)基中，利用組織剪將顱蓋骨破碎并加入0.25%胰蛋白酶，37℃消化30分鐘。加入含血清培養(yǎng)基終止消化。然后在37℃條件下，加入1.2g/L I型膠原酶消化45分鐘后加入冷 PBS終止消化。吸取上清液，1000r/min離心10分鐘，培養(yǎng)液沖洗細胞，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下，以1×106密度將細胞懸液接種于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 骨肽對成骨細胞的增殖影響:取對數(shù)生長的第3代成骨細胞，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時，然后更換含不同濃度骨肽培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，胰蛋白酶消化細胞，制備細胞懸液，乙醇固定后用PI染色，以流式細胞儀分析細胞周期，并計算細胞增殖指數(shù)

1.2.3 骨肽對成骨細胞作用:骨肽按照濃度分為0.02mg/ml、0.08mg/ml、0.32mg/ml三個劑量組，對照組加入正常細胞培養(yǎng)基。分別在24小時、48小時、72小時利用ELISA試劑盒檢測細胞培養(yǎng)液BMP2含量。

2.結(jié)果

2.1 骨肽對成骨細胞增殖的影響 不同劑量濃度骨肽作用24小時后，各組的光密度值與對照組相比均增高，0.002mg/ml劑量組光密度值與對照組相比 P＜0.05，其中0.08mg/ml，0.32mg/ml劑量組光密度值與對照組相比 P＜0.01，并存在劑量依賴關(guān)系(結(jié)果見圖1)。

圖1 不同劑量骨肽對成骨細胞增殖的影響

2.2 骨肽對成骨細胞BMP2表達的影響 在24小時時間點，骨肽各濃度組與對照組相比BMP2表達量增高(P＜0.05)。在48小時時間點，與對照組相比骨肽各濃度組BMP2表達量依然增高，其中0.08mg/ml劑量組BMP2表達量增高明顯，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)，而0.02mg/ml和0.32mg/ml兩個劑量組BMP2表達量與24小時時間點相比無統(tǒng)計學(xué)差異。在72小時時間點，骨肽各濃度組BMP2表達量與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(結(jié)果見表1)。

表1 不同劑量、不同時間骨肽對成骨細胞BMP2表達的影響(±s)

表1 不同劑量、不同時間骨肽對成骨細胞BMP2表達的影響(±s)

注:*與對照組相比P＜0.05，Δ與對照組相比P＜0.01。

骨肽(mg/ml) 成骨細胞BMP2表達量24小時 48小時 72小時對照組 0.23+0.04 0.25+0.03 0.22+0.05 0.02 0.32+0.05* 0.33+0.08* 0.25+0.03 0.08 0.37+0.11* 0.48+0.12Δ 0.24+0.07 0.32 0.38+0.12* 0.39+0.05*0.24+0.05

3.討論

骨肽是從豬和胎牛四肢骨中經(jīng)高科技生物技術(shù)精制提取的一種新型骨病治療藥物，含有機鈣、磷、無機鈣、無機鹽、微量元素、氨基酸等多種骨代謝的活性肽類代謝因子，通過各種骨生長因子直接作用于成骨細胞，可誘導(dǎo)骨髓細胞轉(zhuǎn)化為成骨細胞，促進骨髓成骨作用，同時調(diào)節(jié)骨代謝，直接調(diào)節(jié)骨鈣磷代謝，增加骨鈣磷沉積，刺激成骨細胞增殖促進骨質(zhì)合成［2，3］。

在骨折缺損的愈合中，成骨細胞的分裂、增殖及骨基質(zhì)沉積是形成新生骨和骨重建的重要過程，成骨細胞的增殖、分化受多種生長因子的調(diào)節(jié)［4］。轉(zhuǎn)移生長因子(Transforming growth factor，TGF)超家族對成骨細胞的形態(tài)學(xué)發(fā)生、增殖、分化起重要作用［5］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)是轉(zhuǎn)化生長因子－β(TGF－β)超家族中的一組多功能細胞因子，具有誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞遷徙、增殖、分化，最終導(dǎo)致軟骨、骨形成的作用［6］。Wegman等［7］研究表明成骨細胞的功能之一是分泌骨形成蛋白－2(BMP－2)，而Boumah等［8］則認為BMP－2有很強的促進成骨細胞分化和誘導(dǎo)體外成骨的能力，被認為是TGF－β家族中活性最高且唯一能單獨誘導(dǎo)成骨的因子，其高表達可以進成骨細胞的增殖與分化。

本研究中，骨肽各濃度組在24小時均可引起B(yǎng)MP2表達升高，提示骨肽可能是通過促進BMP2轉(zhuǎn)錄表達進而完成刺激成骨細胞分裂增殖的能力。在48小時時間點，與對照組相比骨肽各濃度組BMP2表達量依然增高，其中0.08mg/ml劑量組BMP2表達量增高明顯，提示在該濃度和作用時間點刺激BMP2表達能力最強。在72小時，各劑量組對BMP2的表達無明顯影響，分析可能由于骨肽作用強度已經(jīng)達到BMP2表達上限，故BMP2表達無明顯改變。

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2 阮蓮芝.骨肽注射液的臨床應(yīng)用［J］．中國臨床藥學(xué)雜志，2008，17(5):320－323.

3 施萊.骨肽注射液在骨科的應(yīng)用進展［J］．社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志，2010，8(7):38－39.

4 Kaur G，Valarmathi M T，Potts JD.Regulation of osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells on 2D nanorod substrates［J］．Biomaterials，2010，31(7):1732 －1741.

5 KIM Y J，CHUNG J Y，LEE SG，etal.Arsenic trioxide－ induced apoptosis in TM4 Sertoli cells:The potential involvement of p21 expression and p53.phosphorylation［J］．Toxicology，2011，285(3):142 －151.

6 CHEN D，HARRIS M A，ROSSINI G，etal.Bone morphogenetic protein 2(BMP－2)enhances BMP－3，BMP－4，and bone cell differentiation marker gene expression during the induction ofmineralized bone matrix formationin cultures of fetal rat calvarial osteoblasts［J］．Calcif Tissue Int，1997，60(3):283－290.

7 WEGMAN F，BIJENHOF A，SCHUIJFF L，etal.Osteogenic differentiation As a result of BMP－2 plasmid DNA based gene therapy in vitro and in vivo［J］．Eur Cell Mater，2011，21:230－242.

8 BOUMAH C E，SELVAMURUGAN N，PARTRIDGE N C.Transcription in the osteoblast:regulatory mechanisms utilized by parathyroid hormone and transforming growth factor－ beta［J］．Prog Nucleic Acid Res Mol Biol，2005，80:287 －321.