乙醇對簡單節(jié)桿菌生長、生理特性和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

寧 靜，劉莉娜，王 敏，駱健美

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

有機(jī)介質(zhì)微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)是近年來疏水性化合物生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).添加有機(jī)溶劑增強(qiáng)底物的溶解對于提高生物轉(zhuǎn)化效率具有正向作用，但高濃度有機(jī)溶劑對細(xì)胞的毒害作用卻成為限制其使用劑量的重要障礙[1–2].研究表明[3–5]，有機(jī)溶劑積累在細(xì)胞膜上，通過影響膜的理化性質(zhì)，例如，影響細(xì)胞膜作為屏障和能量傳導(dǎo)的功能，導(dǎo)致胞內(nèi)大分子的滲透(如RNA、磷脂和蛋白質(zhì))，同時也可能改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致微生物代謝被阻斷，生長受到抑制，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡.

甾體化合物C1，2 脫氫反應(yīng)是工業(yè)上采用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)甾體藥物的典型反應(yīng)，也是生產(chǎn)氫化潑尼松及其同系物最有價值的反應(yīng).其中，簡單節(jié)桿菌(Arthrobacter simplex)以專一性高、反應(yīng)速率快等優(yōu)點(diǎn)成為工業(yè)生產(chǎn)普遍使用的生產(chǎn)菌株.甾體化合物的全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)多采用添加有機(jī)溶劑的方法促進(jìn)疏水性底物的溶解[6–7].課題組在前期工作中，考察了4 種有機(jī)溶劑(乙醇、DMF、DMSO、甲醇)對簡單節(jié)桿菌TCCC 11037,C1，2 脫氫反應(yīng)的影響，結(jié)果表明4 種有機(jī)溶劑均能提高簡單節(jié)桿菌生物轉(zhuǎn)化醋酸可的松的初始轉(zhuǎn)化速率和最終轉(zhuǎn)化率，其中乙醇的效果最好[8].進(jìn)一步分析了乙醇對菌體生長和細(xì)胞性質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著乙醇濃度的增加，菌體的生長和一些細(xì)胞性質(zhì)如跨膜電位和細(xì)胞通透性均發(fā)生明顯變化[9].

課題組以簡單節(jié)桿菌TCCC 11037 為出發(fā)菌株，通過紫外誘變結(jié)合高濃度乙醇馴化的方法選育得到1個突變菌株TCCC 11037-UV15X1-2，通過固體平板實(shí)驗(yàn)，確定突變菌株TCCC 11037-UV15X1-2 對乙醇的耐受體積分?jǐn)?shù)為10%，且具有較好的遺傳穩(wěn)定性.本文以這兩個乙醇耐性差異菌株為對象，分析其在不同乙醇濃度下的生長特性.同時為了降低菌體生長過程的干擾，采用靜息細(xì)胞，考察乙醇處理對細(xì)胞存活率的影響，并進(jìn)一步分析了細(xì)胞糖代謝能力、細(xì)胞膜電位、細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)和通透性的變化.該工作為深入了解簡單節(jié)桿菌在有機(jī)溶劑下的細(xì)胞性質(zhì)變化，進(jìn)而探討其耐性機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)，為選育耐受高濃度有機(jī)溶劑的C1，2 脫氫反應(yīng)菌株提供科學(xué)指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

簡單節(jié)桿菌(Arthrobacter simplex)出發(fā)菌株TCCC 11037(全文簡稱TCCC 11037)和突變菌株TCCC 11037-UV15X1-2(全文簡稱UV15X1-2)，天津科技大學(xué)微生物制藥研究室保存.

斜面/固體平板培養(yǎng)基見參考文獻(xiàn)[10].

菌體培養(yǎng)基(無機(jī)鹽培養(yǎng)基)(g/L)：葡萄糖5，KH2PO40.875，K2HPO40.175，(NH4)2SO41，MgSO4·7H2,O 0.5，NaCl 0.1，CaCl2·5H2O 0.1，CuSO4·5H2O 0.04，KI 0.1，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.2，MnCl2·4H2O 0.4，ZnSO40.4，(NH4)2,MoO40.2，pH 7.0～7.2.

1.1.2 主要試劑及儀器

羅丹明 123(Rh123)、二乙酸熒光素(FDA)，Sigma 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

JSPM–5200 型原子力顯微鏡，日本日立公司；F–5301PC 型熒光分光光度計，日本島津公司；SBA–90型生物傳感儀，山東省科學(xué)院生物研究所.

1.2 方法

1.2.1 菌體生長曲線的繪制

從保存的斜面上挑取 1 環(huán)菌體接種于裝有30,mL 菌體培養(yǎng)基的250,mL 三角瓶中，160,r/min、32,℃進(jìn)行一級培養(yǎng)，培養(yǎng)36,h 菌體生長進(jìn)入對數(shù)中后期(此時A600＝1.8)，以10%接種量將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到相同的菌體培養(yǎng)基中，160,r/min、32,℃進(jìn)行二級培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每間隔一定時間取樣，測定培養(yǎng)液的A600值，以時間(t)為橫坐標(biāo)，A600為縱坐標(biāo)，繪制菌體生長曲線.

1.2.2 乙醇條件下菌體的生長特性

分別向上述二級培養(yǎng)到對數(shù)中后期的培養(yǎng)液中加入體積分?jǐn)?shù)為 2%、6%、10%的乙醇，32,℃、160,r/min 繼續(xù)培養(yǎng)，24,h 和72,h 后分別取樣，測定菌體的A600.

1.2.3 乙醇對細(xì)胞的處理過程

收集二級培養(yǎng)到對數(shù)中后期的菌體細(xì)胞，用PBS緩沖溶液(pH 7.0)洗滌3 次并重懸，調(diào)節(jié)菌體濃度使A600為1.8，制備成靜息細(xì)胞懸浮液.將上述菌體懸浮液分成若干等份，每份25,mL.向每份中加入乙醇，使其終體積分?jǐn)?shù)為2%、6%、10%，160,r/min、32,℃振蕩處理0.5,h 后，8,000,r/min 離心5,min，收集菌體，用PBS 緩沖溶液洗滌3 次并重懸，進(jìn)行以下參數(shù)的測定.其中，未經(jīng)乙醇處理的細(xì)胞作為對照組.

1.2.4 細(xì)胞存活率的測定

采用平板活菌計數(shù)法測定細(xì)胞的存活率[9].

1.2.5 糖活力保留值的測定

向離心收集后的菌體細(xì)胞中加入10,g/L 葡萄糖水溶液，160,r/min、32,℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4,h 后，取1,mL 樣品，用生物傳感儀測定葡萄糖濃度.糖活力保留值(R)按照式(1)計算.

1.2.6 細(xì)胞膜電位測定

采用Rh123 熒光探針法測定細(xì)胞膜電位[11]，通過測定對照組的Rh123 熒光強(qiáng)度(I對照Rh123)和乙醇處理后的Rh123 熒光強(qiáng)度(I乙醇Rh123)，按照式(2)計算Rh123 的相對熒光強(qiáng)度.

1.2.7 細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)的觀察

菌體細(xì)胞經(jīng)無菌水洗滌2 次，按照文獻(xiàn)[8]的方法制備樣品并觀察.

1.2.8 細(xì)胞通透性的測定

采用FDA 熒光探針法[11]測定細(xì)胞膜對胞外小分子物質(zhì)FDA 的通透性.通過測定對照組的FDA 熒光強(qiáng)度(I對照FDA)和乙醇處理后的FDA 熒光強(qiáng)度(I乙醇FDA)，按照式(3)計算FDA 的相對熒光強(qiáng)度.

同時，通過測定蛋白質(zhì)和核酸的泄漏量[12]來反映細(xì)胞膜對胞內(nèi)大分子物質(zhì)的通透性.

2 結(jié)果與討論

2.1 耐性差異菌株菌體的生長特性

圖1 表示的是兩個菌株在菌體培養(yǎng)基中的生長曲線.由圖1 可知，出發(fā)菌株TCCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2 的生長規(guī)律基本一致：0～12,h 為延滯期，12～36,h 為對數(shù)期，36,h 之后進(jìn)入穩(wěn)定期.但兩個菌株的生長速率與A600卻不盡相同，在對數(shù)生長期(12～36,h)，突變菌株UV15X1-2 的生長速率明顯高于出發(fā)菌株TCCCC 11037，分別為0.183,h-1和0.161,h-1.此外，培養(yǎng)72,h 后，突變菌株UV15X1-2和出發(fā)菌株TCCC 11037 的A600均達(dá)到了最大值，分別為0.796 和0.675，前者比后者增加了17.9%，說明在不添加乙醇的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行生長，突變菌株UV15X1-2 能夠比出發(fā)菌株TCCC 11037 表現(xiàn)出更好的生長特性.

圖1 出發(fā)菌株TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2 的生長曲線Fig.1 Growing curves of TCCC 11037 and UV15X1-2

在兩個菌株生長的對數(shù)中后期(36,h)加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇(2%、6%、10%)，此時菌體生長趨于穩(wěn)定，細(xì)胞的形態(tài)和組成比較一致.繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24,h 和72,h 后取樣測定菌體的A600值，結(jié)果如圖2所示.

圖2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下出發(fā)菌株TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2的生長Fig.2 Growth of TCCC 11037 and UV15X1-2 in the presence of different ethanol concentrations

由圖2 可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從0%增加到2%時，隨著培養(yǎng)時間的延長，出發(fā)菌株的A600值沒有明顯變化，大概在0.671～0.679 之間波動.而突變菌株UV15X1-2 的A600值均有所增加，其在24,h 和72,h的A600值比出發(fā)菌株對應(yīng)時間下的A600值分別提高了15.4%和29.4%.之后，出發(fā)菌株TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2 的生長都隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加受到抑制.但突變菌株UV15X1-2 在不同時間下的A600值均明顯高于對應(yīng)時間下出發(fā)菌株TCCC 11037 的A600值，且隨著時間的延長，兩者差異的幅度有所增加.尤其在乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%和10%下培養(yǎng)72,h 后，突變菌株UV15X1-2 的A600值比出發(fā)菌株TCCC 11037 分別提高了56.0%和81.7%.

此外，在2%、6%、10%乙醇下，隨著培養(yǎng)時間的延長(24～72,h)，出發(fā)菌株TCCC 11037 的A600值呈下降趨勢，而突變菌株UV15X1-2 的A600值隨著培養(yǎng)時間的延長表現(xiàn)出增加的趨勢，說明突變菌株UV15X1-2 經(jīng)過一段較長時間的適應(yīng)，表現(xiàn)出繼續(xù)生長的趨勢，突變菌株UV15X1-2 在乙醇壓力下仍具有一定的生長能力.綜合圖1 和圖2 的結(jié)果可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)0～10%的范圍內(nèi)，突變菌株UV15X1-2比出發(fā)菌株TCCC 11037 表現(xiàn)出更好的生長特性.

2.2 乙醇處理對耐性差異菌株細(xì)胞存活的影響

為考察出發(fā)菌株 TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2 的乙醇耐受能力，分別制備靜息細(xì)胞，向其中加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，處理30,min 后觀察細(xì)胞的存活情況，結(jié)果如圖3所示.由圖3 可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)由0%增加到2%時，突變菌株UV15X1-2的存活率為100.0%，沒有變化，而出發(fā)菌株TCCC 11037 的存活率下降為96.4%.當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大到6%時，突變菌株UV15X1-2 的存活率仍保持在95.0%左右，而出發(fā)菌株TCCC 11037 的存活率則快速下降到75.8%.繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)到10%，兩個菌株的存活率均表現(xiàn)出明顯下降的趨勢，其中突變菌株UV15X1-2 的存活率為75.7%，比出發(fā)菌株高出18.3%.由此可見，突變株UV15X1-2 比出發(fā)菌株TCCC 11037 具有更高的乙醇耐受性能.

圖3 乙醇對出發(fā)菌株TCCC 11037和突變菌株UV15X1-2細(xì)胞存活的影響Fig.3 Effect of ethanol on the cell survival of TCCC 11037,and UV15X1-2

2.3 乙醇處理對耐性差異菌株糖代謝能力的影響

圖4 表示的是不同體積分?jǐn)?shù)乙醇處理對耐性差異菌株糖代謝能力的影響.

圖4 乙醇對出發(fā)菌株TCCC 11037和突變菌株UV15X1-2細(xì)胞糖代謝能力的影響Fig.4 Effect of ethanol on the sugar metabolic activities of TCCC 11037 and UV15X1-2

從圖4 可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，兩個菌株的細(xì)胞糖代謝活力保留值均表現(xiàn)出下降的趨勢.當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)不超過2%時，出發(fā)菌株TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2 的細(xì)胞糖代謝保留值之間沒有明顯差異，分別為92.0%和93.8%；繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，出發(fā)菌株TCCC 11037 的糖代謝活力保留值表現(xiàn)出更為快速的下降趨勢；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到10%時，突變菌株UV15X1-2 的糖代謝活力保留值為77.2%，而出發(fā)菌株TCCC 11037 的糖代謝活力保留值僅為60.6%.由此可見，高濃度乙醇條件下，與突變菌株UV15X1-2 相比，出發(fā)菌株TCCC 11037 的糖代謝能力受到了更為嚴(yán)重影響(糖代謝活力保留值下降更明顯)，這種影響直接決定了微生物在有機(jī)溶劑壓力下的存活情況.

2.4 乙醇處理對耐性差異菌株細(xì)胞膜電位的影響

關(guān)于有機(jī)溶劑對細(xì)胞的毒害作用，目前普遍接受的觀點(diǎn)是有機(jī)溶劑在細(xì)胞膜上積累，影響細(xì)胞膜的基本功能，主要包括細(xì)胞膜作為能量傳導(dǎo)(膜電位)和屏障作用(通透性)的功能[13].Rh123 是一種可透過細(xì)胞膜的陽離子熒光染料，其在正常細(xì)胞中能夠依賴跨膜電位進(jìn)入細(xì)胞基質(zhì)，能特異地吸附于細(xì)胞內(nèi)膜上和細(xì)胞質(zhì)中，發(fā)出黃綠色熒光；而當(dāng)細(xì)胞膜完整性被破壞時，細(xì)胞膜通透性增大，引起線粒體跨膜電位崩潰，Rh123 重新釋放出細(xì)胞，熒光強(qiáng)度會下降[11].圖5 表示的是乙醇處理對菌體細(xì)胞膜電位的影響.

圖5 乙醇對出發(fā)菌株TCCC 11037和突變菌株UV15X1-2細(xì)胞膜電位的影響Fig.5 Effect of ethanol on the membrane potential of TCCC 11037 and UV15X1-2

由圖5 可以看到，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從0%增大到10%，兩個菌株的Rh123 相對熒光強(qiáng)度均不斷減少，即兩個菌株的細(xì)胞膜電位隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加均表現(xiàn)出不斷下降的趨勢.當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時，出發(fā)菌株TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2 的細(xì)胞膜電位最低，分別為64.4%和72.4%.同時，在不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)下，突變菌株UV15X1-2 的細(xì)胞膜電位均高于出發(fā)菌株TCCC 11037.結(jié)合圖4 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，乙醇的加入影響了細(xì)胞的代謝能力和細(xì)胞膜作為能量傳導(dǎo)的功能.與突變菌株UV15X1-2 相比，高濃度乙醇對出發(fā)菌株TCCC 11037 的影響更為明顯，這可能是兩個菌株在乙醇壓力下細(xì)胞存活情況產(chǎn)生差異的重要原因.

2.5 乙醇處理對耐性差異菌株細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)的影響

文獻(xiàn)[14]報道，有機(jī)溶劑能夠插入細(xì)胞膜脂雙分子層，使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)受到影響.因此，通過原子力顯微鏡對兩個菌株在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下的超顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖6 所示.

圖6 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下出發(fā)菌株TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2的超顯微結(jié)構(gòu)Fig.6 AFM images of TCCC 11037 and UV15X1-2 in the presence of different ethanol concentrations

由圖6 可知：對于出發(fā)菌株TCCC 11037，在沒有乙醇的條件下，細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，近似短桿狀，細(xì)胞表面光滑，結(jié)構(gòu)完整；隨著乙醇濃度的增加，形態(tài)逐漸變得不規(guī)則，細(xì)胞表面開始有凹陷，表面結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破損.當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%時，細(xì)胞的超顯微結(jié)構(gòu)觀察到較為明顯的破壞，觀察到有胞漿流出(見圖6(a)箭頭所示)；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加至10%時，細(xì)胞表面變得不平整，胞漿大量流出，細(xì)胞完整性遭到破壞，這時細(xì)胞的存活率、糖代謝能力、細(xì)胞膜電位分別下降了 24.2%、28.1%、16.5%.對于突變菌株UV15X1-2，在沒有乙醇的條件下，細(xì)胞形態(tài)與出發(fā)菌株TCCC 11037 相同.當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%時，菌體表面仍較為平整，保持良好的完整性；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時，觀察到菌體細(xì)胞內(nèi)有少量胞漿流出(見圖6(b)箭頭所示)，這與該條件下觀察到的細(xì)胞存活率和各種生理特性開始下降的結(jié)果是一致的.

2.6 乙醇處理對耐性差異菌株細(xì)胞通透性的影響

簡單節(jié)桿菌作為C1，2 脫氫反應(yīng)菌株，其細(xì)胞通透性是一個重要的生理特性.這一方面是因?yàn)榧?xì)胞通透性影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收或其他物質(zhì)(代謝產(chǎn)物、離子、酶等)的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，對微生物在有機(jī)溶劑壓力條件下的生長與存活至關(guān)重要[15].更重要的是，細(xì)胞通透性對于疏水性底物的跨膜擴(kuò)散以及產(chǎn)物的排出具有重要意義，將直接影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的效率[16].

簡單節(jié)桿菌C1，2 脫氫反應(yīng)的底物——醋酸可的松屬于疏水性的小分子化合物，其進(jìn)入細(xì)胞的方式屬于自由擴(kuò)散，對于物質(zhì)自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞的難易程度，細(xì)胞膜的通透特性是一個非常關(guān)鍵的因素.因此，本文通過測定兩個菌株對疏水性化合物二乙酸熒光素FDA 的通透性和細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì)和核酸)的泄漏量對細(xì)胞的通透性進(jìn)行綜合表征.

FDA 是一種不帶電荷、物理特性與甾體類化合物相類似的親脂性分子.其進(jìn)入細(xì)胞后可被胞內(nèi)酯酶水解得到熒光素而被截留在細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)DA 熒光強(qiáng)度增大，表明細(xì)胞損傷，通透性增加，但細(xì)胞又未死亡[11].不同乙醇體積分?jǐn)?shù)處理對菌體細(xì)胞FDA 通透性的影響如圖7 所示.

圖7 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下出發(fā)菌株TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2的FDA相對熒光強(qiáng)度Fig.7 Effect of ethanol on the FDA relative fluorescence intensity of TCCC 11037 and UV15X1-2

由圖7 可知：當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)由0%增加到2%時，兩個菌株的FDA 相對熒光強(qiáng)度基本相同，且表現(xiàn)為增加的趨勢，說明經(jīng)過該體積分?jǐn)?shù)的乙醇處理能增加細(xì)胞對疏水性小分子物質(zhì)的通透性.繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，突變菌株UV15X1-2 的FDA 相對熒光強(qiáng)度繼續(xù)增大，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%時達(dá)到最高，為112.3%.之后，繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)到10%時，F(xiàn)DA 相對熒光強(qiáng)度下降為90.7%，分析可能原因是高濃度乙醇抑制了胞內(nèi)酯酶的活性，這一現(xiàn)象與文獻(xiàn)報道的結(jié)論一致[17].對于出發(fā)菌株TCCC 11037，乙醇體積分?jǐn)?shù)從2%增加到10%時，細(xì)胞的FDA 相對熒光強(qiáng)度不斷下降，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時，F(xiàn)DA相對熒光強(qiáng)度為78.9%.

圖8 表示的是經(jīng)過乙醇處理細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸泄露的變化.由圖8 可知：當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%時，兩個菌株細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì)、核酸)沒有觀察到明顯泄露.繼續(xù)增大乙醇濃度，兩個菌株的蛋白質(zhì)和核酸泄漏量明顯增加.與突變菌株UV15X1-2 相比，出發(fā)菌株TCCC 11037 表現(xiàn)出更為明顯的蛋白質(zhì)和核酸的泄露.

圖8 乙醇處理對出發(fā)菌株 TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸泄漏的影響Fig.8 Effect of ethanol on the protein and nucleic acid leakage of TCCC 11037 and UV15X1-2

由圖7 和圖8 可知，乙醇處理能夠提高細(xì)胞的通透性.但這種通透性對于疏水性化合物生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)能否產(chǎn)生影響還有待于進(jìn)一步研究，目前已有很多通過增強(qiáng)細(xì)胞通透性提高甾體生物轉(zhuǎn)化效率的報道.Korycka-Machala 等[18]研究表明，聚陽離子(例如魚精蛋白、聚乙烯亞胺)通過增加分枝桿菌細(xì)胞壁對疏水性化合物的滲透，β–谷甾醇的轉(zhuǎn)化率提高了3倍；Avramova 等[19]通過制備靜息細(xì)胞，研究了表面活性劑Tween 80 對Rhodococcus sp.細(xì)胞的9,α–羥基化反應(yīng)的影響，結(jié)果表明：采用Tween 80 處理細(xì)胞30,min，可有效提高雄甾–4–烯–3，17–二酮(AD)的轉(zhuǎn)化效率.

3 結(jié)論

(1)突變菌株 UV15X1-2 與出發(fā)菌株 TCCC 11037 相比，在添加了0%～10%體積分?jǐn)?shù)乙醇的菌體培養(yǎng)基中，表現(xiàn)出更好的生長特性.

(2)通過制備靜息細(xì)胞，確定了0%～10%體積分?jǐn)?shù)的乙醇對細(xì)胞存活率的影響.結(jié)果表明，突變菌株UV15X1-2 比出發(fā)菌株TCCC 11037 表現(xiàn)出更好的乙醇耐受性.在6%體積分?jǐn)?shù)乙醇下，出發(fā)菌株TCCC 11037 的糖代謝能力和細(xì)胞膜電位明顯下降，細(xì)胞完整性遭到嚴(yán)重破壞；而突變菌株UV15X1-2 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時才發(fā)生糖代謝活力和細(xì)胞膜電位下降，細(xì)胞完整性破壞的現(xiàn)象.這些細(xì)胞生理特性的變化與菌體細(xì)胞的存活息息相關(guān).

(3)通過測定胞外物質(zhì)FDA 向細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散和胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸向細(xì)胞外的泄漏，考察了乙醇處理對細(xì)胞通透性的影響.結(jié)果表明，與突變菌株UV15X1-2 相比，乙醇對出發(fā)菌株TCCC 11037 細(xì)胞通透性的影響更加明顯，這可能也是該菌株在高濃度乙醇處理下細(xì)胞存活率明顯下降的重要原因.

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