苯并噻唑類化合物對高脂模型小鼠抗氧化能力的影響

花爾并，王秋月，王瑩瑩，劉為鑄，申婷婷

(天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)[1]作為哺乳動物中與酵母菌中Sir2[2](silent information regulator 2)基因的高度同源基因，在體內(nèi)參與調(diào)節(jié)細胞的存活和代謝過程及增殖、衰老和凋亡等生命活動.咪唑并噻唑類化合物(SRT1720)被證明為和白藜蘆醇一樣是SIRT1 激動劑[3]，白藜蘆醇也是一種可改善氧化應激和抗氧化功能紊亂的天然抗氧化劑[4].抗氧化的主要機制與清除自由基等作用有關(guān)，機體在生理代謝過程中存在自由基產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡[5].如果這種動態(tài)平衡被破壞，就會導致對機體的損傷，造成許多疾病如糖尿病、心血管病、癌癥的發(fā)生.清除活性氧是預防這些疾病的一個有效途徑.超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)是清除活性氧的主要抗氧化酶，丙二醛(MDA)含量體現(xiàn)機體脂質(zhì)過氧化程度.這4個指標可用以評價抗氧化能力.

基于目前SIRT1 小分子激動劑的研究剛剛起步，對報道的化合物SRT1720 的結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化設(shè)計合成出結(jié)構(gòu)相關(guān)的SIRT1 小分子激動劑，這從理論和實際操作上都是可行的，并有很大的空間值得去探索，這也是提升新藥研發(fā)潛力的重要手段.本文所用的苯并噻唑類化合物是根據(jù)SIRT1 激動劑SRT1720的結(jié)構(gòu)相關(guān)性設(shè)計2-間苯胺基苯并噻唑(TJ-1)、2-間苯胺基苯并噻唑-3，4，5-三甲氧基苯甲酰胺(TJ-2)和2-間苯胺基苯并噻唑-1H-吡唑-3-甲酰胺(TJ-3)，研究其對于高脂模型小鼠抗氧化能力的影響.

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50只8 周齡健康雄性 C57BL/6,J 小鼠(18～22,g)，購自北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部，許可證編號[SCXK(京)2012-0012].

1.2 試劑與儀器

TJ-1(2-間苯胺基苯并噻唑)、TJ-2(2-間苯胺基苯并噻唑-3，4，5-三甲氧基苯甲酰胺)、TJ-3(2-間苯胺基苯并噻唑-1H-吡唑-3-甲酰胺)由本實驗室自主合成，具體結(jié)構(gòu)如圖1 所示(純度均為95%以上).

圖1 SRT1720、TJ-1、TJ-2、TJ-3的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of SRT1720，TJ-1，TJ-2 and TJ-3

白藜蘆醇(95%)，天津尖峰公司；超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)測定試劑盒、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

UV-9100 紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器廠；UVmini-1240 紫外可見分光光度計，日本島津公司；3K30 高速臺式冷凍離心機，Sigma 公司；SK-1 快速混勻器，江蘇省榮華儀器制造公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 造模方法

小鼠適應性飼養(yǎng)1 周后根據(jù)體質(zhì)量隨機分為5組，每組10只，分別為高脂組、白藜蘆醇對照組、TJ-1組、TJ-2組、TJ-3組.實驗期間小鼠自由攝食、飲水、室內(nèi)溫度(22±2)℃、相對濕度(55±5)%、室內(nèi)通風良好.高脂組喂飼相應高脂飼料，白藜蘆醇對照組和各干預組小鼠喂飼高脂飼料并分別添加0.1%的白藜蘆醇、TJ-1、TJ-2、TJ-3 進行干預.

1.3.2 抗氧化指標測定

干預12 周后小鼠禁食12,h，乙醚麻醉摘眼球取血約1～2,mL，3,000,r/min 離心15,min 分離血清.斷頭摘全腦，以冰冷生理鹽水清理血跡，吸干水分，準確稱量，并加入9 倍體積的無菌冰冷生理鹽水手動制成10%的腦勻漿，4,000,r/min 離心10,min，取上清液置于-85,℃冰箱待用；肝組織勻漿也用同法制備.SOD、GSH-Px、CAT、MDA、考馬斯亮藍蛋白濃度的測定按試劑盒說明書嚴格操作.

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 TJ-1、TJ-2 和TJ-3 對 C57/BL6,J 小鼠血清SOD、GSH-Px、CAT、MDA水平的影響

各組小鼠血清SOD、GSH-Px、CAT、MDA 的水平見表1.與高脂組相比，TJ-1組SOD、CAT 活力顯著升高(P＜0.05)，GSH-Px 活力極顯著升高(P＜0.01)，MDA 含量顯著降低(P＜0.05)；TJ-2組SOD、GSH-Px、CAT 活力顯著升高(P＜0.05)，MDA 含量極顯著降低(P＜0.01)；TJ-3組SOD、GSH-Px 顯著升高(P＜0.05)，CAT 活力無顯著性差異，MDA 含量極顯著降低(P＜0.01)；白藜蘆醇對照組SOD、GSHPx、MDA 均無顯著性差異，CAT 活力顯著升高(P＜0.05).

表1 各組小鼠血清SOD、GSH-Px、CAT、MDA的水平(n＝10)Tab.1 Levels of SOD，GSH-Px，CAT and MDA in serum in all groups(n＝10)

2.2 TJ-1、TJ-2 和TJ-3 對C57/BL6,J小鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT、MDA水平的影響

各組小鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT、MDA 的水平見表2.與高脂組相比，TJ-1組SOD、GSH-Px 活力顯著升高(P＜0.05)，CAT 活力極顯著升高(P＜0.01)，MDA 含量極顯著降低(P＜0.01)；TJ-2組SOD 活力無顯著性差異，GSH-Px 活力顯著升高(P＜0.05)，CAT 活力極顯著升高(P＜0.01)，MDA 含量極顯著降低(P＜0.01)；TJ-3組SOD 活力無顯著性差異，GSH-Px 活力顯著升高(P＜0.05)，CAT 活力極顯著升高(P＜0.01)，MDA 含量極顯著降低(P＜0.01)；白藜蘆醇對照組SOD、GSH-Px 活力無顯著性差異，CAT 活力極顯著升高(P＜0.01)，MDA 含量顯著降低(P＜0.05).

2.3 TJ-1、TJ-2和TJ-3對C57/BL6,J小鼠腦SOD、GSH-Px、MDA水平的影響

各組小鼠腦SOD、GSH-Px、MDA 的水平見表3.與高脂組相比，TJ-1組SOD 活力、MDA 含量均無顯著性差異，GSH-Px 活力顯著升高(P＜0.05)；TJ-2組SOD 活力顯著升高(P＜0.05)，MDA 含量顯著降低(P＜0.05)，GSH-Px 活力無顯著性差異；TJ-3組SOD、GSH-Px 活力極顯著升高(P＜0.01)，MDA 含量無顯著性差異；白藜蘆醇對照組SOD 活力極顯著升高(P＜0.01)，GSH-Px 活力、MDA 含量無顯著性差異.

表2 各組小鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT、MDA的水平(n＝10)Tab.2 Levels of SOD，GSH-Px，CAT and MDA in liver in all groups(n＝10)

表3 各組小鼠腦SOD、GSH-Px、MDA的水平(n＝10)Tab.3 Levels of SOD，GSH-Px and MDA in brain in all groups(n＝10)

3 討論

SIRT1 與眾多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、能量代謝及細胞衰老過程的調(diào)節(jié)有關(guān)，白藜蘆醇能夠激活哺乳動物SIRT1 基因，可以用作SIRT1 基因的小分子激活劑.SRT1720 是一種新型SIRT1 特異性小分子激動劑[6]，體外實驗結(jié)果顯示其激活SIRT1 去乙酰化酶活性是白藜蘆醇的3.3 倍，而效價是它的1,000 倍，并且具有較高的特異性.本實驗運用的苯并噻唑類化合物TJ-1、TJ-2、TJ-3 是根據(jù)SRT1720 的結(jié)構(gòu)相關(guān)性設(shè)計，再進行高脂模型小鼠抗氧化活性的研究.

在正常情況下，機體的氧化和抗氧化系統(tǒng)處于一個動態(tài)平衡中，當某種原因使自由基產(chǎn)生增加或機體抗氧化能力減弱時，平衡就被破壞，可能進一步導致各種病理變化[7].超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)作為機體內(nèi)主要的抗氧化酶，是體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分，機體內(nèi)這些酶活性的高低直接決定了機體的抗氧化水平[8].丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其高低可間接反映機體細胞受氧自由基損傷的程度[9].

朱立賢等[10]用白藜蘆醇對喂飼高脂飼料的大鼠進行干預，結(jié)果表明白藜蘆醇均能降低大鼠血清MDA 含量，還能升高大鼠血清SOD、CAT、GSH-Px活力.本文中比較各組血清抗氧化水平，TJ-1、TJ-2、TJ-3 均提高了SOD、GSH-Px、CAT 活力，降低了MDA 含量，其中白藜蘆醇的效果與朱立賢等[10]的研究成果有一定差異.肝組織是機體代謝的主要組織，含抗氧化相關(guān)酶類最豐富[11].比較各組肝臟抗氧化水平，TJ-1、TJ-2、TJ-3 均提高了SOD、GSH-Px、CAT活力，降低了MDA 含量，且比白藜蘆醇的效果更好.與血清的抗氧化水平相比，TJ-1、TJ-2、TJ-3 對肝臟中CAT 活力的提高是極顯著的，由此可以得出本文所用3 種苯并噻唑類化合物對肝臟的抗氧化水平作用更明顯.腦的抗氧化水平主要是從SOD、GSHPx 和MDA 的水平進行分析，TJ-1、TJ-2、TJ-3 也提高了SOD、GSH-Px、CAT 活力，降低了MDA 含量，但是與血清和肝臟中的抗氧化水平相比作用并不明顯，其中白藜蘆醇的效果與TJ-1、TJ-2、TJ-3 效果基本一致，所以本實驗室自主合成的苯并噻唑類化合物對高脂模型小鼠有一定的抗氧化作用.

［1］Frye R A.Characterization of five human cDNAs with homology to the yeast SIR2 gene ：Sir2-like proteins(sirtuins)metabolize NAD and may have protein ADP-ribosyl transferase activity[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，1999，260(1)：273-279.

［2］Gray S G，Ekstr?m T J.The human histone deacetylase family[J].Experimental Cell Research，2001，262(2)：75-83.

［3］Milne J C，Lambert P D，Schenk S，et al.Small molecule activators of SIRT1 as therapeutics for the treatment of type 2 diabetes[J].Nature，2007，450(7170)：712-716.

［4］Ungvari Z，Orosz Z，Rivera A，et al.Resveratrol increases vascular oxidative stress resistance[J].American Journal of Physiology，2007，292(5)：2417-2424.

［5］Kano M，Takayanagi T，Harada K，et al.Antioxidative activity of anthocyanins from purple sweet potato，Ipomoera batatas cultivar Ayamurasaki[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2005，69(5)：979-988.

［6］Suzuki K，Hayashi R，Ichikawa T，et al.SRT1720，a SIRT1 activator，promotes tumor cell migration，and lung metastasis of breast cancer in mice[J].Oncology Reports，2012，27(6)：1726-1732.

［7］高秋萍，阮紅，毛童俊，等.紫心甘薯多糖的抗氧化活性研究[J].營養(yǎng)學報，2011，33(1)：59-60.

［8］Bokov A，Chaudhuri A，Richardson A.The role of oxidative damage and stress in aging[J].Mechanisms of Aging and Development，2004，125(10/11)：811-826.

［9］田風勝，王芳玲，李華君，等.三黃片對糖尿病患者血清超氧化物歧化酶及丙二醛的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19(1)：16-18.

［10］朱立賢，金征宇.白藜蘆醇苷對高脂血癥大鼠血脂代謝的影響及其抗氧化作用[J].中成藥，2006，28(2)：260-261.

［11］珅史，張澤生，張民，等.蘋果多酚對D-半乳糖致衰小鼠衰老的影響[J].營養(yǎng)學報，2011，33(2)：201-203.