光溫條件對三葉青愈傷生長及黃酮積累的影響

錢麗華，毛碧增

(1.浙江大學(xué)，浙江 杭州 310058;2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

三葉青是中國特有珍稀中藥植物，又名三葉崖爬藤、金線吊葫蘆、蛇附子等，含有黃酮、多糖等生物活性成分，對多種癌癥細(xì)胞株系具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，且對小兒高熱、支氣管炎、病毒性腦膜炎、血液病、心腦血管疾病、抗艾滋病毒和抗腫瘤治療方面具有療效，被稱為安全無毒的“植物青霉素”。目前因過度采挖其野生資源已瀕臨滅絕。雖三葉青組培快繁和扦插技術(shù)均已得到解決，但其塊根形成周期長，產(chǎn)量低，無法滿足市場需求，因此利用組織培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物是解決供需矛盾的可行途徑之一。

目前對三葉青黃酮的研究集中在藥理作用上，對愈傷組織的研究集中在誘導(dǎo)分化上，對光照和溫度條件的研究還較少［1-5］。本研究旨在探索溫度、光周期等培養(yǎng)條件對三葉青愈傷生長及次生代謝物形成積累的影響，為規(guī)?；a(chǎn)三葉青黃酮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

外植體試驗(yàn)材料采自建德市，取其葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并以此為試驗(yàn)材料。

培養(yǎng)基采用MS 基本培養(yǎng)基，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr.Ehrenstorfer GmbH)，微波萃取儀 (美國CEM 公司生產(chǎn))，UV-2550 紫外分光光度計(jì)。無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，亞硝酸鈉(天津博迪化工股份有限公司)，硝酸鋁(上海山浦化工有限公司)，NaOH (杭州化工試劑有限公司)，以上均為分析純。

1.2 處理設(shè)計(jì)

1.2.1 溫度試驗(yàn)

將三葉青葉片來源愈傷組織接種在MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1中，每處理8 瓶，每瓶接5個(gè)。稱取愈傷塊原始質(zhì)量W0，分別放置在23℃，25℃，28℃，30℃，34℃的光照培養(yǎng)箱中12 h·d-1培養(yǎng)30 d 后，再稱取愈傷塊質(zhì)量W1，計(jì)算30 d 內(nèi)愈傷鮮重增長率。愈傷鮮重增長率/%=(W1-W0)/W0×100。

1.2.2 光周期試驗(yàn)

將三葉青葉片來源愈傷組織接種在MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1培養(yǎng)基中，每個(gè)處理5 瓶，每瓶接種7個(gè)愈傷塊，培養(yǎng)溫度為(27 ±1)℃，分別進(jìn)行24 h·d-1和12 h·d-1光照及暗培養(yǎng)30 d 后，測定各處理愈傷組織中總黃酮的含量。

1.3 總黃酮測定

洗去愈傷組織表面瓊脂，吸干表面水分，置于電熱干燥箱中于105℃下干燥0.5 h，使酶失活;然后60℃干燥后，用研缽磨細(xì)，繼續(xù)干燥至恒重。測定方法參照文獻(xiàn)［6］(經(jīng)改良)。

對照品溶液。精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品2.394 5 mg 于25 mL 容量瓶中，加適量50%乙醇超聲溶解，放冷，用50%乙醇定容至25 mL，即為對照品溶液(蘆丁濃度為0.095 78 mg·mL-1)。

供試品60%乙醇溶液。稱取0.3 g 供試品于萃取管中，加入7.5 mL，于微波萃取儀80℃下提取25 min，提取2 次，合并提取液。其他同文獻(xiàn)［6］。

比色測定同文獻(xiàn)［6］方法。

標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別移取供試品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，按比色測定步驟執(zhí)行。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同培養(yǎng)溫度對葉片愈傷繼代培養(yǎng)的影響

在5個(gè)不同溫度處理下，以34℃效果最差，葉片愈傷死亡率高達(dá)100%。說明三葉青葉片愈傷對34℃以上高溫較敏感;另外4個(gè)溫度處理中，28℃下的葉片愈傷組織鮮重增長率達(dá)到394.20%，顯著優(yōu)于其余各處理;其他3個(gè)處理間無顯著差異。故28℃培養(yǎng)溫度最適于三葉青葉片愈傷的生長;超過34℃，則愈傷組織受到高溫傷害后無法修復(fù)而逐漸死亡(圖1)。

圖1 不同培養(yǎng)溫度下愈傷鮮重增長變化

2.2 不同光周期對葉片愈傷中總黃酮含量的影響

3種光周期處理后，24 h·d-1光照有利于三葉青葉片來源愈傷組織中次生代謝物黃酮類化合物的積累。該處理下愈傷組織顏色深綠，結(jié)構(gòu)致密，但表層有褐化現(xiàn)象，總黃酮含量達(dá)20.23 mg·g-1·DW-1(表1);12 h·d-1光照下愈傷組織淺綠，結(jié)構(gòu)致密;黑暗條件下愈傷顏色為淡黃色，表層組織疏松，總黃酮含量明顯低于24 h·d-1的光照處理。因此，24 h·d-1的光照處理是三葉青愈傷組織中黃酮類化合物積累的適宜培養(yǎng)條件。

表1 光周期對愈傷鮮重增長及總黃酮含量的影響

3 小結(jié)與討論

植物組織培養(yǎng)中，光溫條件是影響生長發(fā)育的關(guān)鍵因子，如何根據(jù)植物特性控制培養(yǎng)條件是組培中的重要問題［7］。植物生長發(fā)育具有溫度三基點(diǎn)，即最低溫度、最適溫度和最高溫度。在最適溫度下，植物細(xì)胞生長、分裂活躍，植物生長最快。本試驗(yàn)中，28℃是三葉青愈傷生長的最適溫度。

研究表明，光照在誘導(dǎo)分化時(shí)可激活某些酶的活性和光誘導(dǎo)的葉綠體代謝產(chǎn)物，從而影響細(xì)胞的生長和次生代謝物的積累［8］，但影響的效果因植物種類、試驗(yàn)材料而異。光照對許多植物中黃酮類化合物的合成有誘導(dǎo)作用［9］，葉綠體分化也與黃酮積累有關(guān)［10］，或者光照對苯丙氨酸解氨酶具有激活作用［11］。試驗(yàn)中，24 h·d-1連續(xù)光照有利于三葉青葉片來源愈傷組織中次生代謝物黃酮類物質(zhì)的積累，而黑暗抑制黃酮化合物的合成。這與彭昕等［2］的研究結(jié)果一致。這為今后利用組培技術(shù)規(guī)模化生產(chǎn)三葉青黃酮提供了技術(shù)支撐。

另外，蔗糖、無機(jī)鹽、pH、前體物質(zhì)等對植物組培次生代謝物的形成和積累都存在一定的影響，后期可開展上述因素對三葉青愈傷組織中黃酮積累的影響研究，建立起三葉青愈傷組織生產(chǎn)黃酮的可行技術(shù)工藝。

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