原發(fā)性膽汁性肝硬化患者自身抗體檢測的臨床分析

齊國海 張鳳蘭 寧新麗 趙彥叢

原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是一種發(fā)病機制未明卻與自身免疫系統(tǒng)有關(guān)的慢性肝病，組織病理學檢測可發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)小膽管有非化膿性炎性病變。有研究顯示，90%以上的PBC患者其血清中能夠檢測到抗線粒體抗體(antimitochondrial antibodies，AMA)，因此，可以將 AMA 作為診斷PBC的有效血清學標志［1］。采用間接免疫熒光法(indirect immunofluoresence，IF)檢測PBC患者血清時，其中會出現(xiàn)兩種不同抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)的熒光染色，即多核點型(multiple nuclear dots，MND)ANA和核膜型 (nuclear envelope，NE)ANA，這兩種抗體可被看作PBC的血清學特異性抗體［2］。而MND-ANA主要能識別兩種細胞核蛋白，即Sp100和早幼粒細胞白血病抗原(promyelocytic leukemia antigen，PML)［3］。本研究應(yīng)用 IF及免疫印跡法(immunology blot，IB)對60例PBC患者血清中的MND-ANA和抗-Sp100抗體進行檢測，探討MND-ANA以及抗-Sp100抗體用于疾病的診斷和在臨床中的意義。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取涉縣醫(yī)院2009年1月1日至2011年10月30日的住院及門診PBC患者60例(研究組)，其中男14例，女46例;年齡30～76歲，平均年齡(56±10)歲。對照組選擇涉縣醫(yī)院同期住院及門診患者43例，其中慢性乙型肝炎10例，慢性丙型肝炎7例，干燥綜合征12例，自身免疫性肝炎7例，健康者7例。每例患者臨床資料均詳細可查。采集2組血清，－20℃保存待測。診斷標準參照［4－6］。肝臟病理學檢查:選擇PBC患者中的50例行肝臟病理檢查，所取肝組織常規(guī)石蠟包埋，HE與Masson染色，閱片由同一位高年資病理醫(yī)師進行。

1．2 方法 以IB法檢測肝特異性自身抗體AMA-M2、平滑肌抗體(SMA)、核點蛋白SP100抗體、肝腎微粒體1型(LKM-1)抗體、GP210抗體和肝細胞溶質(zhì)抗原I型(LC-1)抗體。以IF檢測肝ANA、可提取性核抗原(ENA)多肽抗體譜和雙鏈DNA(ds-DNA)。以免疫散射比濁法檢測免疫球蛋白IgA、IgM、IgG和補體 C3、C4。

1．3 組織學分期標準［7］Ⅰ期為匯管區(qū)炎癥僅限于匯管三角;Ⅱ期為顯著的匯管及匯管周圍炎癥，且無間隔纖維化或橋接樣壞死;Ⅲ期為小葉纖維化和(或)橋接樣壞死;Ⅳ期為肝硬化。

1．4統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 10．0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用 χ2檢驗，P ＜0．05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2．1 IF法檢測患者的ANA結(jié)果 檢測患者的ANA結(jié)果通過RBE細胞觀察其中的60例ANA免疫熒光模式，結(jié)果顯示25．0%(15/60)呈現(xiàn) MND 熒光染色陽性，15．0%(9/60)呈現(xiàn)核膜型，8．3%(5/60)呈現(xiàn)著絲點型，均質(zhì)型2例，斑型6例。15例MND-ANA陽性患者中AMA陰性PBC患者5例，AMA陽性PBC患者10例。對照組12例干燥綜合征患者中有MND-ANA陽性1例，著絲點型1例，斑型5例。7例自身免疫性肝炎患者中均質(zhì)型ANA 4例，斑型ANA 1例，MND-ANA陽性2例。而慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎和健康者對照均為陰性。見表1。

表1 IF檢測患者的ANA結(jié)果 例

2．2 PBC患者抗-SP100陽性和陰性的臨床結(jié)果 抗-SP100陽性和陰性PBC患者的相關(guān)結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)，但IgG差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0．05)。見表2。

表2PBC患者抗-Sp100陽性和陰性的相關(guān)結(jié)果±s

表2PBC患者抗-Sp100陽性和陰性的相關(guān)結(jié)果±s

項目 抗-Sp100陽性(n=17) 抗-Sp100陰性(n=43) P值55±7 57±11 ＞0．05 ALT(U/L) 90±17 90±21 ＞0．05 AST(U/L) 1 667±1 184 1 634±1 084 ＞0．05 ALP(U/L) 412±51 418±54 ＞0．05 GGT(U/L) 318±68 324±68 ＞0．05 TBIL(μmol/L) 35±22 36±30 ＞0．05 IgG(g/L) 24±6 15±5 ＜0．05 IgA(g/L) 5．2 ±1．5 4．6 ±2．4 ＞0．05 IgM(g/L) 6．0 ±3．9 5．8 ±2．8 ＞0．05 AMA［例(%)］ 17(100) 43(100) ＞0．05病理早期(Ⅰ/Ⅱ，例) 6 17病理晚期(Ⅲ/Ⅳ，例)年齡(歲，images/BZ_562_2176_2014_2208_2059.png±s)7 20 ＞0．05

3 討論

有文獻證實 MND-ANA能夠識別位于核體上的蛋白［2］。核體是與核基質(zhì)相關(guān)的多蛋白復(fù)合體，它主要包括NDP55、PML、Sp 100和rfp及SUMO-1等。Sp 100蛋白是一種磷酸化的細胞核蛋白，在電泳移動中其相對分子量為100 ku。Szostecki等［8］首先觀察到PBC患者血清中的MND-ANA能識別分子量約100 ku的蛋白，并且將其命名為Sp 100。目前，已知的是Sp 100為轉(zhuǎn)錄活化因子中的一種，適當條件下能觀察到Sp 100蛋白和mRNA的升高狀態(tài)。此外目前對Sp100的其他功能所知較少。

跟其他自身免疫性疾病相似，在PBC患者的血清中除去AMA外還有ANA存在，使用IF法檢測此類血清時，ANA的染色模式分別有斑型、MND、核膜型、著絲點型和均質(zhì)型以及核仁型等，本研究結(jié)果揭示MND及核膜型的ANA可被認為是PBC患者的特異性自身抗體。有研究描述了MND-ANA免疫熒光的模式，并且發(fā)現(xiàn)它的特點是有3～20個大小(0．3～1 μm)不一的點狀染色出現(xiàn)，分布位置是除核仁外的整個細胞核中［9］。

本研究中使用IF法檢測60例PBC患者的血清，發(fā)現(xiàn)有15例MND-ANA陽性，陽性率為25．0%;對照組僅在干燥綜合征和自身免疫性肝炎患者分別出現(xiàn)1例陽性，由此可推斷MND-ANA是PBC的特異性自身抗體，與相關(guān)研究［8］結(jié)論相符。Luettig等［10］對施行肝移植手術(shù)后的PBC患者的跟蹤隨訪資料發(fā)現(xiàn)，移植術(shù)后盡管ANA的滴度下降趨勢明顯，但血清中的ANA仍呈持續(xù)存在狀態(tài)，且其免疫熒光反應(yīng)模式也幾乎未改變。這就更加顯著地揭示了MND-ANA確為PBC的特異性自身抗體，甚至是病變靶器官已經(jīng)被去除的狀態(tài)下該抗體依然能被檢測到。本研究在IF的基礎(chǔ)上，又采用免疫印跡法檢測分析MND-ANA陽性的PBC患者體內(nèi)的抗-Sp100抗體。在所選擇的全部60例PBC患者中，檢測到抗-Sp100陽性17例，陽性率為28．3%，而對照組中只有1例患者檢測到抗-Sp100，這也提示了抗-Sp100是PBC特異性的血清自身抗體。

AMA是診斷PBC的血清學標志物之一，有研究采用IF法檢測AMA的陽性率約為80%，但換用敏感性更好的檢測方法如免疫印跡法或者酶聯(lián)免疫吸附法后，仍會有5%～10%的PBC患者出現(xiàn)AMA陰性［11］。結(jié)合本研究結(jié)果和文獻［9］，筆者建議如果有臨床與組織學的檢查結(jié)果均符合PBC的診斷標準而AMA陰性情況的患者，進一步選擇MND-ANA檢測可能會有助于診斷PBC，這樣也可以避免遺漏和延誤AMA陰性的PBC患者的診斷。

本文也比較了抗-Sp100陰性和陽性PBC患者的相關(guān)臨床資料，結(jié)果顯示這兩類患者在年齡和生化指標以及病理分期方面差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)，但在免疫學指標中IgG的水平陽性患者高于陰性患者(P＜0．05)?？?Sp100能否作為判斷PBC患者病情及預(yù)后的有效指標，還有待于收集整理更多的患者資料進行細致而長期的臨床觀察。本研究結(jié)果提示在PBC病變的早期(Ⅰ/Ⅱ)抗-Sp100陽性率跟晚期(Ⅲ/Ⅳ)無差異(P＞0．05)，揭示了抗-Sp100是在PBC的病變早期時即已經(jīng)存在。

本研究顯示，抗核抗體在PBC中的陽性率較高，實際操作中可作為PBC的初篩實驗;另外其在PBC中以核膜型為主，而著絲點型次之，臨床醫(yī)療工作中，若其ANA結(jié)果呈現(xiàn)高滴度的核膜型，可作為一個提示，提醒臨床醫(yī)生檢測抗線粒體，來判斷此患者體內(nèi)是否有抗線粒體抗體存在，從而為PBC的早期診治提供依據(jù)。

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