尤瑞克林對(duì)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

張學(xué)艷 張幽燕 常紅云

腦血管病是一種常見(jiàn)病和多發(fā)病，其發(fā)病率、致殘率、病死率均較高。腦缺血急性期及時(shí)恢復(fù)腦血流灌注，改善缺血區(qū)血供，一直是治療缺血性腦卒中的重點(diǎn)。尤瑞克林主要成分為人尿激肽原酶，能分解產(chǎn)生血管緩激肽和血管舒張素，實(shí)驗(yàn)研究表明:應(yīng)用尤瑞克林能夠減少腦梗死面積［1］，減輕神經(jīng)功能受損，其機(jī)制可能與促進(jìn)血管新生和神經(jīng)細(xì)胞增殖、遷移、分化、減少細(xì)胞凋亡等有關(guān)［2］。藥效學(xué)研究顯示，尤瑞克林可選擇性擴(kuò)張缺血部位細(xì)小動(dòng)脈，改善梗死灶內(nèi)供血［3］，并促進(jìn)損傷部位新生血管生成［4］，從而對(duì)急性腦梗死起到治療作用。腦缺血的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中細(xì)胞凋亡仍然是腦缺血損傷機(jī)制研究的重要內(nèi)容。凋亡是指機(jī)體在生理?xiàng)l件下受到刺激后，經(jīng)過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細(xì)胞程序性死亡的過(guò)程。關(guān)于尤瑞克林從細(xì)胞凋亡角度對(duì)腦保護(hù)作用機(jī)制國(guó)內(nèi)筆者很少見(jiàn)報(bào)道。本研究從細(xì)胞凋亡角度探討尤瑞克林的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用尤瑞克林提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選用成年健康SD大鼠60只，雌雄各30只，體重250～300 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物級(jí)別:普通級(jí)。隨機(jī)分為假手術(shù)組、單純?nèi)毖M、尤瑞克林組(低劑量組、中劑量組、高劑量組)，每組12只。參照文獻(xiàn)［5］給藥:尤瑞克林組用滅菌0．9%氯化鈉溶液分別稀釋為3．75 ×10－3、8．75 ×10－3、17．25 ×10－3PNA單位/kg，給藥量1 ml/kg，分別于缺血后30 min及23．5 h 2次經(jīng)舌下靜脈給藥。余2組予同等劑量0．9%氯化鈉溶液。

1．2 試劑與儀器 注射用尤瑞克林(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司提供)。bcl-2、bax蛋白測(cè)定試劑盒:武漢博士德生物工程公司。連續(xù)變倍體視顯微鏡160×:桂林儀器廠;CIAS-1000型圖像分析儀:北京大恒圖象視覺(jué)有限公司;LKBⅢ型超薄切片機(jī):瑞典;電子天秤:上海天平儀器廠;石英自動(dòng)雙重純水蒸餾器:江蘇丹陽(yáng)門(mén)石英玻璃廠;烘片、烤片機(jī):孝感市電子儀器廠。

1．3 局灶性腦缺血模型制備 參照Longa等采用線(xiàn)栓法［6］制備MCAO，大鼠手術(shù)前12 h禁食不禁水，健康SD大鼠稱(chēng)重后，按10%水合氯醛0．3 ml/100 g腹腔注射麻醉。固定，常規(guī)消毒，取頸正中切開(kāi)，剪開(kāi)淺筋膜，暴露胸鎖乳突肌、右側(cè)頸總動(dòng)脈、迷走神經(jīng)、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、翼腭動(dòng)脈，在近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈及翼腭動(dòng)脈。距頸總動(dòng)脈分叉處近心端0．5 cm處剪一小口，插入頭端燒成圓鈍形直徑為0．235 mm的尼龍魚(yú)線(xiàn)，進(jìn)線(xiàn)長(zhǎng)度18～19 mm在大腦中動(dòng)脈起始端堵塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈，然后將頸總動(dòng)脈連同尼龍魚(yú)線(xiàn)一起結(jié)扎，縫合皮膚，放回籠內(nèi)單籠喂養(yǎng)。假手術(shù)組只分離、暴露血管，不結(jié)扎頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，不插入尼龍魚(yú)線(xiàn)。術(shù)后保持環(huán)境溫度25～30℃。尤其要注意動(dòng)物頭部的保溫。

1．4 觀察指標(biāo)

1．4．1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分［6］:參考經(jīng)典的 Longa 等［7］的方法對(duì)大鼠在MCAO術(shù)后清醒后到24 h進(jìn)行3次神經(jīng)功能評(píng)分，取平均值。0:無(wú)明顯神經(jīng)功能喪失;1:不能完全伸展左側(cè)前爪;2:向左側(cè)旋轉(zhuǎn)，環(huán)形運(yùn)動(dòng);3:行走時(shí)向左側(cè)傾倒;4:不能自行行走，意識(shí)水平下降。

1．4．2 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)缺血側(cè)大腦皮層 bcl-2、bax的表達(dá):5組大鼠行MCAO，24 h后行腦灌注固定后取腦，取雙側(cè)大腦冠狀位距嗅球尖端6～11 mm腦組織塊，放入多聚甲醛液固定24 h，常規(guī)梯度脫水、透明、石蠟包埋。從冠狀面中1/3層面開(kāi)始留取切片，厚度5 μm，連續(xù)切片，備用。將其進(jìn)行免疫組化SABC法染色，操作嚴(yán)格參照武漢博士德公司說(shuō)明書(shū)。判斷標(biāo)準(zhǔn)及方法:對(duì)于大鼠MCAO模型，Shi等［8］研究指出，缺血側(cè)大腦半球距離嗅球尖端7～11 mm、矢狀裂至外側(cè)裂上1/3的皮質(zhì)組織由大腦前動(dòng)脈和中動(dòng)脈雙重供血，缺血較輕，表現(xiàn)為半暗區(qū)的變化。每只大鼠各取3張腦組織切片，在顯微鏡下定位，取缺血側(cè)(假手術(shù)組取假手術(shù)側(cè))大腦皮層頂葉第三層外錐體細(xì)胞層，隨機(jī)采集5個(gè)高倍視野(10×40)，參照Quaini等［9］采用雙盲法計(jì)算每個(gè)高倍鏡視野bcl-2及bax陽(yáng)性細(xì)胞率(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)+陰性細(xì)胞數(shù))×100%。細(xì)胞胞質(zhì)含有棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，各指標(biāo)組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 術(shù)后大鼠多于1 h內(nèi)清醒，假手術(shù)組動(dòng)物均活動(dòng)正常，無(wú)神經(jīng)功能缺損，神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0分，單純?nèi)毖M動(dòng)物神經(jīng)功能缺損評(píng)分最為嚴(yán)重;與單純?nèi)毖M相比，尤瑞克林組各組均能改善局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(P＜0．05或＜0．01)且隨劑量升高呈量效關(guān)系。其中單純?nèi)毖M及尤瑞克林中劑量組各1只大鼠死亡，剔除。見(jiàn)表1。

表1神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較±s

表1神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較±s

注:與單純?nèi)毖M比較，*P ＜0．05，#P ＜0．01

?

2．2 缺血側(cè)大鼠大腦皮層bcl-2、bax陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)個(gè)數(shù)結(jié)果

尤瑞克林各劑量組bcl-2、bax陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率均明高于單純?nèi)毖M(P ＜0．05或 ＜0．01)，且呈劑量依賴(lài)性關(guān)系。見(jiàn)表2，圖 1、2。

表2 5組對(duì)大腦皮層bcl-2、bax陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)影響

圖1 大腦皮層bcl-2表達(dá)(免疫組化×400)

圖2 大腦皮層bax表達(dá)(免疫組化×400)

3 討論

腦缺血后，由于腦缺血缺氧致氧自由基大量生成、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激損傷等，使腦組織損傷進(jìn)行性加重。缺血性腦血管病的高致殘率及病死率與腦缺血后大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因調(diào)控和凋亡效應(yīng)的執(zhí)行等。各種凋亡相關(guān)蛋白在調(diào)控凋亡發(fā)生的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)大鼠MCAO后，腦缺血半暗區(qū)的凋亡細(xì)胞在缺血1 h即可出現(xiàn)，隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增多，凋亡的特征性改變主要發(fā)生于缺血后12～24 h，48 h以后凋亡細(xì)胞明顯減少，72 h以后凋亡表現(xiàn)逐漸消失，半暗區(qū)內(nèi)的神經(jīng)元已基本全部死亡［10］。研究表明，bax為促進(jìn)細(xì)胞凋亡;bcl-2增高抑制細(xì)胞凋亡，且bcl-2基因家族是決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡以及凋亡嚴(yán)重性的重要因素［11］。因此，各種藥物可以通過(guò)促進(jìn)bc1-2蛋白表達(dá)，減少bax蛋白表達(dá)，來(lái)抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡，對(duì)腦損傷起保護(hù)作用。

注射用尤瑞克林是從男性尿液中提取精制的組織型激肽原酶，能催化激肽原水解產(chǎn)生激肽。研究證實(shí)，組織激肽原酶能促進(jìn)一氧化碳生成，改善腦組織供血，能選擇性擴(kuò)張腦細(xì)小動(dòng)脈，改善缺血腦組織血供和氧供，減輕氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)新生血管發(fā)生，減少細(xì)胞凋亡，從而對(duì)急性腦梗死起到治療作用［12，13］。且注射用尤瑞克林及其相關(guān)代謝產(chǎn)物對(duì)缺血部位的靶向性作用強(qiáng)，可成為缺血性腦血管病的最重要的治療藥物之一。

本研究結(jié)果顯示:腦缺血后24 h大鼠缺血性病理?yè)p傷及神經(jīng)功能缺損癥狀嚴(yán)重，低、中、高劑量尤瑞克林能使神經(jīng)功能缺損癥狀減輕，說(shuō)明尤瑞克林對(duì)腦缺血有保護(hù)作用。尤瑞克林可促進(jìn)抑凋亡基因bcl-2蛋白的表達(dá)，并下調(diào)促凋亡基因bax蛋白的表達(dá)，從而減少腦缺血后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且隨劑量增加治療效果越明顯，呈劑量依賴(lài)性。說(shuō)明尤瑞克林對(duì)大鼠腦缺血損傷有很強(qiáng)的保護(hù)作用。其保護(hù)機(jī)制可能抑制腦缺血損傷中神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕遲發(fā)性神經(jīng)元壞死，保存神經(jīng)細(xì)胞功能，從而達(dá)到治療目的。

本研究還發(fā)現(xiàn)單純?nèi)毖M缺血側(cè)腦組織較假手術(shù)組bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)增多，腦缺血后bcl-2的這種變化可能是神經(jīng)細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制之一，可防止或減少缺血時(shí)腦組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

1 Emanueli C，Madeddu P．Angiogenesis therapy with human tissue kallikrein for the treatment of ischemic diseases．Arch Mal Coeur Vaiss，2004，97:679-687．

2 Chao J，Chao L．Kallikrein-kinin in stroke cardiovascular and renal disease．Exp Physiol，2005，90:291-298．

3 Xia CF，Yin H，Borlongan CV．Kallikrein gene transfer protects against ischemic stroke by promoting glial cell migration and inhibiting apoptosis．Hypertension，2004，43:452-459．

4 李昌盛，閔拮，湛彥強(qiáng)，等．利用激光散斑成像技術(shù)觀察尤瑞克林對(duì)腦梗死大鼠腦血流的影響．中華神經(jīng)科雜志，2010，43:732-736．

5 屈志煒，蘇丹，張麗英，等．凱力康對(duì)大鼠局灶性腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究．中國(guó)處方藥，2005，44:73-75．

6 xu X，Ye L，Ruan Q．Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia inrats．Exp Biol Med(Maywood)，2009，234:296-305．

7 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats．Stroke，1989，20:84-91．

8 Shi J，Panickar KS，Yang SH，et al．Estrogen attenuates over-expression of beta-amyloid precursor protein messager RNA in an animal model of focal ischemia．Brain Res，1998，810:87-92．

9 Quaini F，Cigola E，Lagrasta C，et al．End-stage cardiac failure in humans is coupled with the induction of proliferating cell nuclear antigen and nuclear mitotic division iventricular myocytes．Circ Res，1994，75:1051-1063．

10 陳元新，林祥通，沈冰．大鼠永久性腦缺血及缺血再灌注后半暗帶caspase-3mRNA表達(dá)變化．復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2001，28:490-493．

11 De Bilbao F，Guarin E，Nef P，et al．Cell death is prevented in thalamic fields but not in injured neocortical areas after permanent focal ischaemia in mice overexpressing the anti-apoptotic protein Bcl-2．Etr J Neurosci，2000，12:921-934．

12 謝惠芳，徐如祥，魏繼鵬，等．大鼠腦缺血再灌注損傷后磷酸化JAK2、STAT3蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡．南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27:208-211．

13 Chao J，Bledsoe G，Yin H，et al．The tissue kallikrein-kinin system protects against cardiovascular and renal diseases and ischemic stroke independently of blood pressure reduction．Biol Chem，2006，387:665-675．