N-乙酰-L-半胱氨酸對慢性間歇性缺氧大鼠血壓變化及內皮功能的影響*

劉 雪， 鄧 燕， 尚 進， 楊秀紅， 劉輝國， 徐永健

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS)是臨床上常見的綜合征，慢性間斷缺氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)是其主要的病理生理特征，與OSAHS所致的靶器官損害密切相關。流行病學調查顯示，OSAHS與高血壓相關密切，約50%～60%的OSAHS患者合并高血壓，同時，約50%的高血壓患者伴有OSAHS［1］。OSAHS與高血壓不僅具有相關關系而且還存在因果關系，內皮功能失調是引發(fā)心血管疾病包括高血壓病的重要病理生理基礎［2］，主要表現(xiàn)為血管內皮細胞合成、釋放舒血管活性因子如一氧化氮(nitric oxide，NO)、前列環(huán)素等及縮血管活性因子如內皮素1(endothelin-1，ET-1)、黏附分子等功能失調，從而導致血管張力、血管平滑肌增殖等調控功能異常，其中最為重要因素為ET-1和NO的水平失衡。多項臨床研究證實，OSAHS合并高血壓患者血清ET-1和NO水平不同于正常對照組［3-5］。因此，我們采用大鼠間歇缺氧模型，模擬OSAHS患者存在的間歇缺氧的病理生理過程，同時選用抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸 (N-acetyl-L-cystein，NAC)干預，觀察大鼠的尾動脈收縮壓、主動脈內皮功能和血清氧化應激指標的變化，從而探討CIH導致高血壓時的血管內皮功能及其相關機制。

材料和方法

1 慢性間歇缺氧大鼠模型的建立和分組

隨機將30只體重為180～200 g的8周齡雄性健康SD大鼠(華中科技大學同濟醫(yī)學院動物中心提供)分為正常對照組﹑CIH組和NAC干預CIH組，每組10只。參考文獻的方法［6］，自制密閉的有機玻璃間歇缺氧箱，按氣體流動方向設置進氣﹑出氣孔，從進氣孔向密閉缺氧箱中循環(huán)充入氮氣和壓縮空氣，每一個循環(huán)過程為110 s，即55 s充入氮氣，隨后55 s充入壓縮空氣，用數(shù)字測氧儀(上海市嘉定學聯(lián)儀表廠)檢測缺氧箱中的氧濃度，調節(jié)氣流流量，目的是使每一個循環(huán)缺氧箱內的最低氧濃度能達到7% ～8%，持續(xù)約30～40 s，然后逐漸恢復到21%左右，持續(xù)約30～40 s。充入氮氣和壓縮空氣之間的轉換通過定時電磁閥來完成。CIH組大鼠置于間歇缺氧箱中，每天持續(xù)8 h，共4周。正常對照組大鼠置于相同的缺氧箱中，但不給予缺氧處理。NAC治療組每日在間歇缺氧前給予NAC(意大利贊邦集團)300 mg/kg灌胃，CIH組及正常對照組給予等體積生理鹽水灌胃。

2 大鼠尾動脈收縮壓的測定

選取造模前1 d和造模結束第2 d的尾動脈收縮壓作為測定結果，正式測量前10 d需每天測量大鼠尾動脈血壓。尾動脈收縮壓的具體測定方式參照文獻方法并加以改進［7-8］。具體操作如下:在安靜環(huán)境中，將大鼠放入用白布制作的鼠袋內，把大鼠尾壓測量儀(華中科技大學同濟醫(yī)學院心內科實驗室提供)的尾部氣囊和脈搏換能器依次套于大鼠尾部的近心端，換能器的表面對準大鼠尾腹面，換能器與心電圖的肢體導聯(lián)相連，用電吹風加熱大鼠尾部，小心調整鼠尾和換能器接觸部位，當心電圖機描記出等幅規(guī)律擺動的脈搏波動時給氣囊加壓，阻斷大鼠尾動脈搏動后放氣，當心電圖機上重新出現(xiàn)脈搏波時測壓儀壓力表上的讀數(shù)(mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)即為大鼠的尾動脈收縮壓。每只大鼠反復測量3次，取平均值。

3 血液和組織樣品的采集和處理

3.1 血液樣品的采集和處理 用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠成功后，給予注射肝素鈉(1×105U/L)0.5 mL，沿腹中線切開皮膚，腹主動脈取血，置于肝素化的離心管中，3 000 r/min離心20 min，分離出血漿，于－20℃存放待測。

3.2 組織樣品的采集和處理 取血后迅速開胸，分離主動脈，用100 mL生理鹽水快速灌注沖洗血液，取出胸主動脈，然后迅速在手術顯微鏡下去除殘余血管鞘脂肪與周圍結締組織并剝離血管外膜，生理鹽水清洗，濾紙吸干后稱重100 mg，制成10%動脈勻漿，3 000 r/min離心10 min后去上清，保存于－20℃待測。另一部分新鮮離體血管立即將其置于無RNase的凍存管中－80℃凍存，用于mRNA的檢測等。

4 實時熒光定量PCR測定胸主動脈內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和ET-1 mRNA的表達

取100 mg血管組織加入Trizol(Invitrogen)1.0 mL研磨勻漿充分裂解，室溫靜置5 min;加入氯仿1/5體積，4℃、12 000 r/min離心15 min，抽取上清約500～600 μL，加入等體積異丙醇混勻，冰上靜置10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，75%乙醇1 mL洗滌2次，4℃ 12 000 r/min離心5 min，棄上清，室溫放置5 min，加 DEPC水30 μL，立即保存液氮或者測RNA濃度。按逆轉錄試劑盒(TaKaRa)說明書合成cDNA;real-time PCR按照SYBR Green real-time PCR Master mix(TaKaRa)說明書進行。eNOS上游引物5’-GAT CCA GTG GGG GAA ACT G-3’，下游引物5’-TGT GGT TAC AGA TGT AGG TGA ACA-3’;ET-1上游引物5’-AAG CGT TGC TCC TGC TCC TCC-3’，下游引物 5’-TTC CCT TGG TCT GGT CTT TGT G-3’。內參照 β-actin上游引物5’-CCA ACC GTG AAA AGA TGA CC-3’，下游引物 5’-ACC AGA GGC ATA CAG GGA CA-3’。反應條件(ABI PRISM 7500 real-time PCR儀):95℃預變性30 s后，95℃ 5 s，64℃ 34 s，共40次循環(huán)，每個循環(huán)后采集熒光生成擴增曲線。在同一次反應中，各組均設3個平行重復;反應結束后，設定閾值，軟件輸出Ct值;根據(jù)比較Ct值公式，獲得不同組間基因表達比值，具體公式為:2－ΔΔCt，其中 ΔΔCt= ΔCt實驗組－ΔCt對照組，ΔCt=Ct目的基因－Ct管家基因

5 Western-blotting檢測eNOS蛋白表達

取冰凍血管組織，按組織蛋白抽提試劑盒說明書(武漢谷歌生物公司)提取大鼠胸主動脈勻漿蛋白，按Bradford法測蛋白含量，調整蛋白濃度，經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，Ⅰ抗(武漢博士德公司)孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗孵育2 h，化學發(fā)光法顯色，βactin為內對照。用eNOS與β-actin條帶的吸光度比表示eNOS蛋白相對表達量。

6 血清中NO和ET-1水平以及胸主動脈ET-1和超氧陰離子(superoxide anion，O－·2)水平的檢測

采用放射免疫法測定血清及胸主動脈ET-1水平;采用硝酸還原酶法測定血清中NO含量，二者均嚴格按照試劑盒(南京建成自由基測試盒)說明檢測。組織勻漿超氧陰離子的測定采用NBT還原法，新鮮離體血管制備成1%主動脈組織勻漿立即檢測，按照(南京建成自由基測試盒)說明檢測。

7 血漿超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平的檢測

采用黃嘌呤氧化酶法測定外周血漿SOD活性，采用硫代巴比妥酸法測定外周血漿MDA含量，二者均嚴格按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書的步驟進行檢測。

8 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各組大鼠尾動脈收縮壓比較

各組大鼠血壓的變化差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與正常對照組［(105.95 ±9.43)mmHg］相比，CIH 組大鼠尾動脈收縮壓［(150.61 ±7.31)mmHg］明顯增高(P＜0.01);而NAC 治療組［(140.68±7.52)mmHg］較CIH組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 實驗前后平均動脈壓Table 1.Mean arterial blood pressure at the onset and the end of experiment(mmHg.Mean ± SD.n=10)

2 各組大鼠外周血清ET-1和NO含量的變化

CIH組大鼠血清 ET-1水平［(190.24+11.41)ng/L］明顯高于正常對照組［(130.14 ±9.32)ng/L］，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而NAC治療組［(169.42+11.01)ng/L］較 CIH 組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

CIH 組大鼠血清 NO水平［(26.54±5.13)μmol/L］明顯低于正常對照組［(54.61 ±7.10)μmol/L］，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而NAC治療組［(35.76 ±6.28)μmol/L］較 CIH 組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

3 各組大鼠胸主動脈eNOS和ET-1 mRNA表達的變化

CIH組 eNOS mRNA 表達(0.45±0.12)明顯低于正常對照組(1.00±0.13)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);NAC 治療組(0.63±0.09)明顯高于CIH組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

CIH組ET-1 mRNA 表達(2.01±0.21)明顯高于正常對照組(1.00±0.12)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);NAC 干預組(1.64±0.17)明顯低于 CIH組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

4 各組大鼠胸主動脈eNOS和ET-1蛋白表達的變化

CIH 組 eNOS蛋白表達(0.18±0.03)明顯低于正常對照組(0.60±0.02)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);NAC 治療組(0.34 ±0.03)高于 CIH 組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1。

CIH 組ET-1 蛋白表達［(9.84 ±0.36)ng/L］明顯高于正常對照組［(6.22± 0.30)ng/L］，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01);NAC干預組［(8.13±0.60)ng/L］明顯低于CIH組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

5 氧化應激指標的測定

5.1 大鼠胸主動脈O－·2水平CIH組［(166.00±26.27)U/(g protein)］明顯高于正常對照組［(103.5±23.29)U/(g protein)］，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而NAC治療組［(134.00±22.31)U/(g protein)］較CIH組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表3。

Figure 1.The expression of eNOS protein in rat thoracic aorta.Mean±SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs CIH group.圖1 大鼠胸主動脈eNOS水平

表2 各組大鼠胸主動脈eNOS mRNA、ET-1 mRNA、ET-1蛋白以及循環(huán)中ET-1和NO水平的比較Table 2.The eNOS mRNA，ET-1 mRNA and ET-1 protein in thoracic aorta，and the circulating levels of ET-1 and NO among the three groups(mean±SD.n=10)

5.2 大鼠外周血血漿中MDA含量CIH組［(3.07±0.68)μmol/L］明顯高于正常對照組［(1.86±0.57)μmol/L］，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而NAC治療組［(2.84±0.69)μmol/L］較CIH組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表3。

5.3 大鼠外周血漿 SOD活性 CIH組［(90.94±17.79)×103U/L］明顯低于正常對照組［(151.67±20.63)×103U/L］，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而NAC治療組SOD活性［(124.30±15.85)×103U/L］較 CIH組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見表3。

表3 大鼠氧化應激指標的變化Table 3.The oxidative stress indexes among the three groups(mean±SD.n=10)

討 論

近年來，OSAHS與高血壓的相關關系已經(jīng)得到公認，OSAHS為年齡、性別、肥胖、吸煙、酗酒、生活壓力及心臟、腎臟疾病以外的高血壓發(fā)病的獨立危險因素［1］。在OSAHS患者合并高血壓和血管合并癥的發(fā)病機制中，反復缺氧/復氧造成氧化應激和內皮功能障礙發(fā)揮了關鍵作用［9］。本實驗研究證明間歇性缺氧造成大鼠尾動脈收縮壓升高、氧化應激損傷和血管活性因子分泌失衡。然而，間歇缺氧導致氧化應激和內皮功能失調導致高血壓發(fā)生的確切機制還不清晰。

已證實氧化應激與OSAHS存在密切關系［10］，Xu等［11］和我們既往研究［12-13］也均證實在腦組織和主動脈間歇缺氧也可增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平。eNOS作為內皮源性血管舒張因子NO表達的限速性因素，催化左旋精氨酸合成NO，此過程為氧依賴過程。低氧和氧化應激可抑制eNOS基因轉錄速率及其mRNA穩(wěn)定性，限制NO協(xié)同因子產生，直接影響血管床NO形成及釋放。CIH在轉錄及轉錄后水平都對eNOS有抑制作用［14-15］。Jelic等［15］的臨床研究發(fā)現(xiàn)，OSAHS患者由于氧化應激和炎癥使NO利用率和修復能力下降，從而直接損傷血管內皮功能。

ET-1是至今發(fā)現(xiàn)的最強的內皮源性血管收縮因子［16］。Kanagy等［17］認為暴露在間歇缺氧的大鼠血壓升高依賴于血清中升高的ET-1。Peng等［18］研究報道，間歇缺氧的小鼠中氧化應激和高血壓存在相關性，間歇缺氧產生大量ROS，特別是O－·2，對ET-1依賴的高血壓有必要作用;同時，氧化應激產生的ROS可誘導ET-1的產生，ET-1通過前反饋活化內皮素受體A，激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶［19］，使ROS產生增加，然而其詳細機制目前不清楚。Troncoso-Brindeiro等［20］研究認為，ROS的增加是ET-1產生的上游，而非下游。因此，我們推測氧化應激參與內皮舒縮功能變化，引起內皮功能紊亂，導致高血壓病的發(fā)生。

NAC作為一種強有力的抗氧化劑，不僅具有清除自由基功能，本身亦可轉化合成強抗氧化應激物質谷胱甘肽［21］。因此我們采用NAC進行抗氧化應激作用的干預。本研究結果表明，NAC干預CIH組與CIH組比，eNOS mRNA和蛋白水平合成明顯增加，ET-1 mRNA和蛋白合成降低，同時外周血清NO升高，ET-1降低。NAC干預CIH組外周血SOD活力增高，而MDA、超氧陰離子含量以及尾動脈收縮壓均較CIH組明顯降低。推測NAC干預CIH氧化應激狀態(tài)，使ROS產生降低，一方面，eNOS合成增多，ROS直接滅活NO的作用減弱，NO依賴的血管擴張作用增強;另一方面，NAC使ET-1合成減少，外周血清ET-1減低，血管收縮功能減緩，從而導致血壓降低。由此可見，NAC具有抗氧化和保護血管內皮的功能，可防治慢性間歇缺氧導致心血管并發(fā)癥的發(fā)生。

［1］ Silverberg DS，Oksenberg A.Are sleep-related breathing disorders important contributing factors to the production of essential hypertension?［J］.Curr Hypertens Rep，2001，3(3):209-215.

［2］ Luscher TF.The endothelium and cardiovascular disease:a complex relation［J］.N Engl J Med，1994，330(15):1081-1083.

［3］ Gjorup PH，Sadauskiene L，Wessels J，et al.Abnormally increased endothelin-1 in plasma during the night in obstructive sleep apnea:relation to blood pressure and severity of disease ［J］.Am J Hypertens，2007，20(1):44-52.

［4］ Jordan W，Reinbacher A，Cohrs S，et al.Obstructive sleep apnea:Plasma endothelin-1 precursor but not endothelin-1 levels are elevated and decline with nasal continuous positive airway pressure［J］.Peptides，2005，26(9):1654-1660.

［5］ Schulz R，Schmidt D，Blum A，et al.Decreased plasma levels of nitric oxide derivatives in obstructive sleep apnoea:response to CPAP therapy ［J］.Thorax，2000，55(12):1046-1051.

［6］ Neubauer JA.Invited review:Physiological and pathophysiological responses to intermittent hypoxia［J］.J Appl Physiol，2001，90(4):1593-1599.

［7］ Garcia-Covarrubias L，Manning EW 3rd，Sorell LT，et al.Ubiquitin enhances the Th2 cytokine response and attenuates ischemia-reperfusion injury in the lung［J］.Crit Care Med，2008，36(3):979-982.

［8］ Sampaio RC，Tanus-Santos JE，Melo SE，et al.Hypertension plus diabetes mimics the cardiomyopathy induced by nitric oxide inhibition in rats［J］.Chest，2002，122(4):1412-1420.

［9］ Atkeson A，Yeh SY，Malhotra A，et al.Endothelial function in obstructive sleep apnea ［J］.Prog Cardiovasc Dis，2009，51(5):351-362.

［10］ Wysocka E，Cofta S，Cymerys M，et al.The impact of the sleep apnea syndrome on oxidant-antioxidant balance in the blood of overweight and obese patients［J］.J Physiol Pharmacol，2008，59(Suppl 6):761-769.

［11］ Xu W，Chi L，Row BW，et al.Increased oxidative stress is associated with chronic intermittent hypoxia-mediated brain cortical neuronal cell apoptosis in a mouse model of sleep apnea［J］.Neuroscience，2004，126(2):313-323.

［12］ Liu HG，Liu K，Zhou YN，et al.Effect of NADPH oxidase activity inhibitor apocynin on blood pressure in rats exposed to chronic intermittent hypoxia and the possible mechanisms［J］.Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi，2008，31(12):921-925.

［13］ Liu H，Liu K，Zhou Y et al.Apocynin attenuate spatial learning deficits and oxidative responses to intermittent hypoxia［J］.Sleep Med，2010，11(2):205-212.

［14］ Suzuki YJ，Jain V，Park AM，et al.Oxidative stress and oxidant signaling in obstructive sleep apnea and associated cardiovascular diseases［J］.Free Radic Biol Med，2006，40(10):1683-1692.

［15］ Jelic S，Padeletti M，Kawut SM，et al.Inflammation，oxidative stress，and repair capacity of the vascular endothelium in obstructive sleep apnea［J］.Circulation，2008，117(17):2270-2278.

［16］周 曉，商戰(zhàn)平，司艷紅，等.槲皮素抑制內皮素－1誘導的人臍動脈平滑肌細胞T型鈣通道的表達［J］.中國病理生理雜志，2011，27(3):450-454.

［17］Kanagy NL，Walker BR，Nelin LD.Role of endothelin in intermittent hypoxia-induced hypertension［J］.Hypertension，2001，37(2 Part 2):511-515.

［18］ Peng YJ，Yuan G，Ramakrishnan D，et al.Heterozygous HIF-1α deficiency impairs carotid body-mediated systemic responses and reactive oxygen species generation in mice exposed to intermittent hypoxia［J］.J Physiol，2006，577(Pt 2):705-716.

［19］ Pollock DM，Pollock JS.Endothelin and oxidative stress in the vascular system［J］.Curr Vasc Pharmacol，2005，3(4):365-367.

［20］ Troncoso-Brindeiro CM，da Silva AQ，Allahdadi KJ，et al.Reactive oxygen species contribute to sleep apnea-induced hypertension in rats［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293(5):H2971-H2976.

［21］ Zafarullah M，Li WQ，Sylvester J，et al.Molecular mechanisms of N-acetylcysteine actions［J］.Cell Mol Life Sci，2003，60(1):6-20.