內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)血管反應(yīng)性降低與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放的關(guān)系*

甘稼夫， 胡 畔， 劉良明

膿毒性休克存在血管低反應(yīng)性，它嚴(yán)重影響了休克的復(fù)蘇和治療。休克后血管反應(yīng)性降低的發(fā)生機(jī)制目前認(rèn)為主要有受體失敏、膜超極化及鈣失敏機(jī)制［1］，但針對上述機(jī)制研發(fā)的一些恢復(fù)血管反應(yīng)性的藥物效果卻非常有限，提示可能還有其它調(diào)控因素參與血管低反應(yīng)性的發(fā)生。基礎(chǔ)研究顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞的一種自身保護(hù)性反應(yīng)，但是嚴(yán)重或持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mi-tochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2］，該途徑參與糖尿病、脂肪性肝炎、心臟病等多種慢性疾病的發(fā)生發(fā)展［3-4］。近年來，有關(guān)失血/創(chuàng)傷、休克等危急重癥存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的報(bào)道也日益增多。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與休克后血管低反應(yīng)性的發(fā)生，與MPTP有何種關(guān)系，尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用大鼠盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)膿毒性休克模型，分別從整體動物模型和離體血管環(huán)水平研究了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否可誘導(dǎo)血管反應(yīng)性降低及其與MPTP的關(guān)系。

材料和方法

1 動物和試劑

SD大鼠體重(210±15)g，雌雄不拘，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號(SYXK2002-032)。?；撬?taurine)、毒胡蘿卜素(thapsin)、環(huán)孢素 A(cyclosporin A，CsA)、抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78(glucose-regulated protein 78，GRP78)抗體和抗CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)抗體均購自 Sigma，DMEM/F12培養(yǎng)基購自HyClone，胎牛血清為PAA產(chǎn)品，電泳相關(guān)試劑購自Promega，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠Ⅱ抗和SuperSignal發(fā)光增強(qiáng)試劑盒為Pierce產(chǎn)品。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 動物模型及分組

SD大鼠45只分為正常對照組、CLP 1 h、CLP 2 h、CLP 4 h 、CLP 6 h、CLP 8 h和 CLP 6 h+?；撬?7組，CLP 1 h、CLP 2 h和CLP 4 h 3組每組3只，用于檢測GRP78和CHOP表達(dá)，其余4組每組9只，其中3只用于檢測GRP78和CHOP表達(dá)，6只用來檢測血管反應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用戊巴比妥鈉(30～50 mg/kg，ip)麻醉，沿腹中線縱向切開腹腔，暴露并結(jié)扎盲腸，用三菱錐刺入盲腸末端造瘺，縫合關(guān)閉腹腔，右側(cè)股動脈插管并經(jīng)三通管連接水銀血壓計(jì)，經(jīng)插管注射肝素鈉生理鹽水(500 U/kg)抗凝，觀察血壓，平均動脈壓降至基礎(chǔ)水平的70%以下可界定為膿毒性休克。各組在到達(dá)相應(yīng)時(shí)點(diǎn)后處死大鼠，取腸系膜上動脈(superior mesenteric artery，SMA)，清除周圍結(jié)締組織，用于血管反應(yīng)性和GRP78及CHOP表達(dá)測定。正常組大鼠插管，不造瘺。

3 離體血管環(huán)孵育及分組

SD大鼠24只分為對照組、毒胡蘿卜素孵育組、毒胡蘿卜素+牛磺酸組和毒胡蘿卜素+CsA組，每組6只。戊巴比妥鈉麻醉后，消毒腹部皮膚，處死大鼠，取出腸系膜上動脈，無菌PBS液清洗并清除周圍結(jié)締組織，制作成2～3 mm長的血管環(huán)。將血管環(huán)放入有完全培養(yǎng)基的24孔板內(nèi)，加入各處理藥物，在培養(yǎng)箱中孵育24 h:毒胡蘿卜素8 μmol/L，?；撬?0 mmol/L，CsA 0.2 μmol/L。

4 血管反應(yīng)性測定

將腸系膜上動脈制成2～3 mm血管環(huán)，掛于注有K-H液的離體器官灌流槽中，持續(xù)沖入95%O2和5%CO2混合氣體，給予初張力0.5 g，37℃恒溫孵育2 h，每20 min換液1次，待張力曲線平穩(wěn)后，測定血管環(huán)對去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)的反應(yīng)性。血管環(huán)的血管反應(yīng)性用NE濃度累積法測定，使所用 NE 終濃度分別為 1 ×10－9、1 ×10－8、1 ×10－7、1×10－6和1×10－5mol/L，記錄不同 NE 濃度下血管環(huán)產(chǎn)生的最大收縮反應(yīng)(Emax)，以收縮力/血管環(huán)質(zhì)量(g/mg)為量化標(biāo)準(zhǔn)，做量－效曲線，用NE的Emax和量－效曲線評價(jià)血管的反應(yīng)性。

5 Western blotting檢測GRP78和CHOP

將血管組織置于預(yù)冷的蛋白裂解液［pH 7.6(mmol/L):HEPES 50，NaCl 150，EDTA 1，NP-40 1%，β-glycerophosphate 20，Na3VO41，NaF 1，benzamidine 1，para-nitrophenyphosphate 5，DTT 1，protein kinase inhibitor colktail pit］于冰浴中剪碎組織并勻漿，將上清置冰浴中凍融1 h;上清經(jīng)1 000×g離心10 min(4℃)，收集上清即為胞漿總蛋白。采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。等量樣品蛋白(每泳道120 μg)經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)移完畢后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入抗GRP78(1∶1 000)或抗CHOP 抗體(1∶1 000)孵育過夜，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記II抗(1∶8 000)室溫孵育1 h，將待測的硝酸纖維素膜置于SuperSignal發(fā)光增強(qiáng)試劑中反應(yīng)2～3 min后，迅速用塑料膜包裹硝酸纖維素膜，與X-ray膠片一同放入暗盒中曝光2～5 min，再將膠片顯影、定影，結(jié)合膜上所標(biāo)記的蛋白marker位置，確定蛋白條帶的相應(yīng)分子量。將膠片置于圖像分析儀中，對目標(biāo)條帶進(jìn)行掃描及灰度分析。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件系統(tǒng)處理，組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。作圖軟件為Origin 5.0。

結(jié) 果

1 膿毒性休克后不同時(shí)點(diǎn)大鼠腸系膜上動脈GRP78和CHOP的表達(dá)變化及血管反應(yīng)性變化

CLP后不同時(shí)點(diǎn) SMA內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子GRP78和CHOP表達(dá)呈逐漸增高趨勢，并于CLP后6 h達(dá)到高峰，用?；撬崽幚砗驡RP78和CHOP表達(dá)顯著下降，見圖1。CLP膿毒性休克后血管反應(yīng)性顯著下降，SMA對NE的量－效曲線明顯右移，Emax顯著下降(P＜0.01)，用牛磺酸處理后SMA對NE的量－效曲線明顯左移，反應(yīng)性得到顯著恢復(fù)，Emax顯著上升(P＜0.05)，見圖2。上述結(jié)果提示膿毒性休克后血管存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與休克后的血管低反應(yīng)性密切相關(guān)。

Figure 1.The changes of protein expression of GRP78 and CHOP in SMA from CLP septic shock rats and the effect of taurine(Tau).C:control.圖1 CLP膿毒性休克大鼠腸系膜上動脈GRP78和CHOP表達(dá)變化及?；撬釋ζ涞挠绊?/p>

2 毒胡蘿卜素孵育后大鼠SMA對NE的反應(yīng)性變化

經(jīng)毒胡蘿卜素孵育24 h后，大鼠SMA的反應(yīng)性顯著降低，對NE的量－效曲線明顯右移，Emax顯著下降(P＜0.01)，用牛磺酸處理后SMA對NE的量－效曲線明顯左移，Emax顯著上升(P＜0.05)，反應(yīng)性得到顯著恢復(fù)，見圖3。這提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠誘導(dǎo)血管反應(yīng)性降低。

3 CsA孵育后大鼠SMA對NE的反應(yīng)性變化

經(jīng)毒胡蘿卜素孵育后，大鼠SMA的反應(yīng)性顯著降低，對NE的量－效曲線明顯右移，Emax顯著下降(P＜0.01);用CsA共同孵育24 h后，大鼠SMA的反應(yīng)性顯著升高，對NE的量－效曲線明顯左移，Emax顯著上升(P＜0.01)，見圖4。這提示毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的血管反應(yīng)性降低與MPTP開放有關(guān)。

Figure 4.The changes of the reactivity of SMA to NE after co-inbubation with cyclosporin A(CsA)and thapsin.Mean ± SD.n=8.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs thapsin.圖4 CsA孵育后大鼠SMA對NE的反應(yīng)性變化

討 論

膿毒性休克、創(chuàng)傷失血性休克等臨床重癥存在血管低反應(yīng)性，即血管對血管活性藥物的反應(yīng)降低或不反應(yīng)。這種血管低反應(yīng)性是導(dǎo)致嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克晚期血壓降低，病人難以治療的重要原因之一?；诩∪馐湛s效率取決于力/鈣比率(force/Ca2+ratio)，前期本實(shí)驗(yàn)室提出并證實(shí)了“休克后血管平滑肌細(xì)胞肌肉收縮蛋白可能存在鈣失敏，鈣失敏在休克后血管低反應(yīng)性的發(fā)生中起重要作用”的鈣失敏機(jī)制［5］，并發(fā)現(xiàn)PKG、PKC和Rho激酶參與休克后血管平滑肌細(xì)胞鈣敏感性的調(diào)控。針對鈣失敏機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)小劑量的精氨酸加壓素［6］(arginine vasopressin，AVP;0.4 U/kg)具有一定的血管反應(yīng)性恢復(fù)作用，但仍不能完全恢復(fù)至正常水平;此外，針對休克血管低反應(yīng)性發(fā)生的受體失敏和膜超極化機(jī)制的治療措施也不能完全恢復(fù)血管反應(yīng)性，這提示可能還有其它調(diào)控因素參與休克后血管低反應(yīng)性的發(fā)生?；A(chǔ)研究顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是由缺血缺氧、氧化應(yīng)激、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等病理生理刺激導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量積聚的亞細(xì)胞應(yīng)激。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能使細(xì)胞發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，從而調(diào)整和保護(hù)自己，包括暫停蛋白質(zhì)的翻譯、上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子GRP78的表達(dá)等。當(dāng)過強(qiáng)或持續(xù)的應(yīng)激不緩解時(shí)則可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具體途徑包括上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激另一標(biāo)志性分子CHOP的表達(dá)、誘導(dǎo)MPTP開放等。MPTP開放介導(dǎo)線粒體途徑的凋亡是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性凋亡的重要部分，并且參與多種疾病的發(fā)生。由此我們推測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能通過MPTP誘導(dǎo)血管反應(yīng)性降低。

本研究采用CLP膿毒性休克模型，觀察了CLP后不同時(shí)點(diǎn)GRP78和CHOP的表達(dá)變化，同時(shí)觀察了腸系膜上動脈血管反應(yīng)性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CLP后隨著時(shí)間的延長，血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子GRP78和CHOP的表達(dá)增加，呈逐漸增高趨勢。而用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑?；撬崽幚砗?，GRP78和CHOP表達(dá)顯著下降。CLP膿毒性休克后血管反應(yīng)性顯著下降，牛磺酸處理后血管反應(yīng)性得到顯著恢復(fù)。結(jié)果提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與休克后的血管低反應(yīng)性密切相關(guān)。進(jìn)一步采用離體血管環(huán)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素孵育觀察其對血管反應(yīng)性的影響及?；撬岷虲sA的作用。結(jié)果表明，毒胡蘿卜素能夠顯著降低離體血管環(huán)的血管反應(yīng)性，?；撬崮軌蝻@著恢復(fù)血管反應(yīng)性，CsA也能夠顯著恢復(fù)血管反應(yīng)性。上述結(jié)果提示，感染膿毒性休克可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，后者通過誘導(dǎo)MPTP開放，導(dǎo)致血管的反應(yīng)性降低。

目前普遍認(rèn)為毒胡蘿卜素是體外誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的工具藥，其機(jī)制是通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡所致［6］。毒胡蘿卜素誘導(dǎo)血管低反應(yīng)性是否是由于影響血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度所致，我們沒有直接測定胞內(nèi)鈣離子濃度變化，但我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本可以排除毒胡蘿卜素導(dǎo)致血管反應(yīng)性下降是因胞內(nèi)鈣離子濃度變化直接所致。因?yàn)槎竞}卜素處理后細(xì)胞漿內(nèi)的鈣濃度應(yīng)該是升高的，按理經(jīng)毒胡蘿卜素處理后血管反應(yīng)性應(yīng)該增高，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示經(jīng)毒胡蘿卜素處理后血管反應(yīng)性是降低的，說明毒胡蘿卜素誘導(dǎo)血管反應(yīng)性降低非細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度直接引起。確切關(guān)系需以后同步觀察胞內(nèi)鈣離子濃度變化與血管反應(yīng)性的關(guān)系來確定。本實(shí)驗(yàn)所用毒胡蘿卜素的劑量和作用時(shí)間，均參考相關(guān)文獻(xiàn)能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的劑量和作用時(shí)間［7］。CsA 是公認(rèn)的 MPTP 的抑制劑［8-9］。以往的研究顯示MPTP開放主要參與細(xì)胞的凋亡調(diào)控，有研究顯示MPTP介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑參與了休克后血管高滲透性的發(fā)生［10］。本研究結(jié)果初步顯示MPTP參與了休克后血管低反應(yīng)性發(fā)生。MPTP介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑是否參與這一過程尚需深入研究。作為機(jī)體的內(nèi)源性物質(zhì)，?；撬峋哂袧B透壓調(diào)控、鈣平衡調(diào)節(jié)、維持細(xì)胞膜穩(wěn)定和抗氧化等作用，多個(gè)研究顯示?；撬崮軌蛲ㄟ^調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)、抗氧化等作用抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，本實(shí)驗(yàn)檢測的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子結(jié)果也證實(shí)牛磺酸能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。但牛磺酸發(fā)揮血管功能保護(hù)作用的確切機(jī)制尚需下步深入研究。

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