辛伐他汀通過抑制p38 MAPK活化降低肝硬化門靜脈高壓大鼠門靜脈壓力*

陳埏芳， 鐘 健， 湯紹輝， 陳昭琳， 吳小娟， 胡建軍， 勞學軍

門靜脈高壓癥(portal hypertension，PHT)是肝硬化失代償期的主要臨床表現(xiàn)之一，包括側(cè)支循環(huán)的建立和開放、腹水和脾大。食道靜脈曲張、破裂出血是肝硬化患者死亡的重要原因之一，其主要預(yù)防措施是降低門靜脈壓力(portal pressure，PP)［1］。目前臨床上常用的降低門靜脈壓力、預(yù)防食道靜脈叢出血的藥物是普萘洛爾，但只有不到50%患者獲得較滿意的療效;加之應(yīng)用普萘洛爾后，肝臟血液灌注減少，可能使肝功能損害加重，故限制了其臨床應(yīng)用［2］。因此，探索新的降低門靜脈壓力的藥物已成為當前的研究熱點。

近年來，一些動物實驗［3-4］和臨床研究［2，5］顯示，他汀類藥物可改善硬化肝臟的竇內(nèi)皮功能障礙，降低肝內(nèi)血管阻力，進而降低門靜脈壓力，改善肝臟灌注。其機制與改變RhoA/Rho激酶和PI3K/Akt信號通路活性，增加肝臟內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達水平和提高其活性，使一氧化氮(nitric oxide，NO)釋放增加相關(guān)。既往有研究顯示，辛伐他汀可以抑制p38 MAPK信號通路，提高臍靜脈內(nèi)皮細胞eNOS的表達水平［6］。提示辛伐他汀增加肝硬化肝臟組織NO釋放可能是通過改變p38 MAPK信號通路活性，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究報道。鑒于此，本研究擬構(gòu)建大鼠肝硬化門靜脈高壓癥模型，探討辛伐他汀降低肝硬化門靜脈壓力的機制是否有p38 MAPK信號通路的參與，為其臨床應(yīng)用提供更充實的實驗依據(jù)。

材料和方法

1 材料

辛伐他汀(舒降之)購于杭州默沙東制藥有限公司，四氯化碳(分析純)購于天津化學試劑公司，抗p38 MAPK、抗磷酸化p38 MAPK、抗eNOS和抗磷酸化eNOS抗體購于Cell Signaling Technology，抗β-actin抗體購于 Abcam，p38 MAPK特異性抑制劑SB203580購于Calbiochem。

2 方法

2.1 肝硬化門靜脈高壓癥大鼠模型的制備 雄性SD大鼠57只，正常飼養(yǎng)至體重達250～280 g，隨機取11只大鼠作為正常對照，普通飲食;余46只采用四氯化碳復(fù)合因素改良法［7］制作大鼠肝硬化PHT模型。即前2周喂養(yǎng)含79.5%玉米面、20%豬油、0.5%膽固醇的高脂飼料，10%乙醇為其唯一飲料;從第3周起改為喂養(yǎng)含99.5%玉米面、0.5%膽固醇的飼料，第4周后乙醇濃度提高至15%，直至造模結(jié)束。四氯化碳給藥采取皮下多點注射法，造模第1 d首次按每100g體重皮下注射60%四氯化碳0.5 mL，之后每隔3 d按每100 g體重皮下注射40%四氯化碳0.3 mL。第6周起給藥間隔時間延長至7 d，劑量改為2 mL/kg，造模時間持續(xù)8周后模型形成。

2.2 肝硬化門靜脈高壓癥模型大鼠實驗干預(yù) (1)實驗分為3組:辛伐他汀治療組11只，p38 MAPK抑制劑SB203580處理組10只，模型組10只;另設(shè)正常對照組8只(給予普通飲食)。(2)干預(yù)方法為:辛伐他汀組給予辛伐他汀 20 mg/kg，每天1次灌胃;SB203580組給予SB203580 1 mg/kg，每天1次灌胃;模型組給予等量蒸餾水灌胃。此外這3組繼續(xù)給予造模飲食，共4周。

2.3 實驗指標檢測

2.3.1 大鼠血流動力學檢測 造模及干預(yù)實驗結(jié)束，大鼠禁食12 h，不禁飲水，右頸動脈插管測量平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)，門靜脈插管測量PP。MAP和PP采用BL-410生物機能系統(tǒng)測量并記錄。

2.3.2 大鼠肝功能檢測 測壓完后立即從門靜脈采血，以2 000 r/min的速度離心20 min后取血清，－20℃貯存，檢測大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bil-irubin，TBIL)、白蛋白(albumin，ALB)等肝功能指標。

2.3.3 大鼠肝臟組織學檢測 取肝右葉組織，經(jīng)10%甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片，4 μm厚度。采用HE染色檢測大鼠肝臟組織學改變。

2.3.4 Western blotting 檢測 p38 MAPK、磷酸化 p38 MAPK、eNOS及磷酸化eNOS蛋白表達變化 取液氮保存的大鼠肝臟組織100 mg，加入蛋白裂解液，制備組織總蛋白。測定蛋白濃度后，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，用脫脂奶粉封閉。加入稀釋的Ⅰ抗(抗p38 MAPK、抗磷酸化 p38 MAPK、抗 eNOS、抗磷酸化eNOS及抗β-actin)和辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，增強化學發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描定量，分別計算各目標蛋白與β-actin的吸光度比值。

2.3.5 大鼠肝臟NO含量檢測 取100 mg液氮保存的大鼠肝臟組織制備成組織勻漿，采用Griess重氮化反應(yīng)方法測定NO含量，按照試劑盒說明操作。

3 統(tǒng)計學處理

計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0進行ANOVA或獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 造模結(jié)果

造模至第8周末，隨機抽取3只正常及3只模型大鼠進行開腹測壓，模型大鼠門靜脈壓力［(17.30±1.11)cmH2O］明顯高于正常大鼠門靜脈壓力［(8.20 ±1.10)cmH2O］(P ＜0.01)，與 Trebicka等［4］報道相似，表明門靜脈高壓癥形成。正常大鼠肝臟外觀色澤紅潤，表面光滑，無黏連，見圖1A;模型大鼠肝臟大體觀色澤暗，表面油膩、欠光滑，有黏連，部分肝緣變鈍或呈鋸齒狀，見圖1B。上述結(jié)果表明造模成功。

Figure 1.Hepatic morphology of normal control(A)and model(B)rats圖1 正常對照組和模型組大鼠肝臟大體形態(tài)

2 肝硬化門靜脈高壓癥模型大鼠干預(yù)實驗結(jié)果

2.1 血流動力學檢測結(jié)果 干預(yù)結(jié)束，測壓結(jié)果顯示，辛伐他汀治療組及SB203580處理組PP均明顯低于模型對照組(P＜0.01)，辛伐他汀治療組PP也明顯低于SB203580處理組(P＜0.01)。上述3組間MAP比較無顯著差異(P＞0.05)，見表1。

表1 辛伐他汀對肝硬化門靜脈高壓癥模型大鼠血流動力學的影響Table 1.Effect of simvastatin on hemodynamics in rats with cirrhosis and portal hypertension(mean±SD)

2.2 肝功能檢測結(jié)果 辛伐他汀治療組、SB203580處理組及模型組ALT、AST和TBIL水平均明顯高于正常對照組(P＜0.01)，而ALB水平均明顯低于正常對照組(P＜0.01)。辛伐他汀治療組、SB203580處理組及模型組3組之間ALT、AST、TBIL及ALB水平無明顯差異(P＞0.05)，見表2。

表2 辛伐他汀對肝硬化門靜脈高壓癥模型大鼠肝功能的影響Table 2.Effect of simvastatin on liver function in rats with cirrhosis and portal hypertension(mean±SD)

2.3 肝臟組織學改變 正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝竇形態(tài)正常(圖2A)。模型組(圖2B)大鼠肝細胞脂肪變性明顯，大量纖維增生形成假小葉，假小葉內(nèi)肝細胞排列紊亂，中央靜脈缺如，肝竇形態(tài)失常，纖維間隔內(nèi)有大量炎癥細胞浸潤。辛伐他汀治療組(圖2C)及SB203580處理組(圖2D)大鼠肝臟組織學外觀與模型對照組相比，除肝細胞脂肪變性減輕外，其余表現(xiàn)與模型對照組相似。

Figure 2.Histological changes of rat hepatic tissues(HE staining，× 200).A:normal control group;B:model group;C:simvastatin treatment group;D:SB203580 treatment group.圖2 各組大鼠肝臟組織學變化

2.4 Western blotting結(jié)果 與正常大鼠相比，模型組大鼠肝臟總p38 MAPK及總eNOS蛋白表達水平無明顯變化(P＞0.05)，而磷酸化p38 MAPK蛋白及磷酸化eNOS蛋白表達水平分別增高與降低(P＜0.01)。與模型組比較，辛伐他汀治療組大鼠肝臟總p38 MAPK蛋白表達水平無明顯變化(P＞0.05)，總eNOS蛋白表達水平增高(P＜0.01)，而磷酸化p38 MAPK蛋白及磷酸化eNOS蛋白表達水平分別降低與增高(P＜0.01);SB203580處理組大鼠肝臟總p38 MAPK蛋白及總eNOS蛋白表達水平無明顯變化(P＞0.05)，而磷酸化p38 MAPK蛋白及磷酸化eNOS蛋白表達水平分別降低與增高(P＜0.01)，但磷酸化eNOS蛋白表達水平增高的程度低于辛伐他汀治療組(P ＜0.01)，見圖3。

2.5 大鼠肝臟NO含量檢測結(jié)果 辛伐他汀治療組［(15.73 ±1.59)μmol/(g protein)］及 SB203580處理組［(13.98 ±1.27)μmol/(g protein)］肝臟組織NO含量明顯高于模型組［(9.81±1.12)μmol/(g protein)］(P＜0.01)，辛伐他汀治療組也高于SB203580處理組(P＜0.01)，但上述3組NO含量均低于正常對照組［(18.70 ±1.85)μmol/(g protein)］(P ＜0.01)。

討 論

Figure 3.Western blotting analysis of total p38 MAPK，p-p38 MAPK，total eNOS，and p-eNOS protein expression in hepatic tissues of rats.Mean ± SD.n=8 ～ 11.＊＊P ＜0.01 vs normal control;##P ＜0.01 vs model;△△P ＜0.01 vs SB203580.圖3 4組大鼠肝臟Western blotting分析結(jié)果

他汀類藥物是3-羥-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑，可以阻斷HMG-CoA轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢u戊酸，從而顯著減少膽固醇的合成，是目前臨床上廣泛使用的降脂藥。近年來研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物還有多種非降脂作用。Zafra等［5］用辛伐他汀治療肝硬化患者，發(fā)現(xiàn)它能夠增加肝臟內(nèi)NO釋放，降低肝內(nèi)血管阻力。Trebicka等［4］研究顯示，阿托伐他汀可降低肝硬化大鼠肝內(nèi)血管阻力，從而降低門靜脈壓力，而且不影響平均動脈壓。最近，Abraldes等［2］報道了一項隨機、雙盲、安慰劑對照臨床研究，以評價連續(xù)應(yīng)用(1個月)辛伐他汀對肝硬化門靜脈高壓癥患者肝靜脈壓力梯度(hepatic venous pressure gradient，HVPG)的影響及其安全性，結(jié)果顯示，辛伐他汀可顯著降低HVPG及改善肝臟灌注，且對全身血流動力學無明顯影響，其不良事件的發(fā)生頻率與安慰劑組相似，表明辛伐他汀確實可降低肝硬化患者的門靜脈壓力。

研究顯示，他汀類藥物降低肝硬化門靜脈壓力的機制涉及以下方面:肝硬化時，肝臟RhoA/Rho激酶信號通路活化，引起eNOS抑制，使肝內(nèi)NO產(chǎn)生減少;他汀類藥物是HMG-CoA還原酶抑制劑，可抑制膽固醇及其生物合成過程中的中間代謝產(chǎn)物類異戊二烯的合成，后者是引起小分子單體 G蛋白(RhoA、Ras、Rac等)激活的關(guān)鍵分子。這樣，他汀類藥物可通過抑制類異戊二烯的合成而顯著降低RhoA/Rho激酶信號通路的活性，引起肝內(nèi) eNOS mRNA及蛋白表達水平上調(diào)［4］;另一方面，RhoA/Rho激酶信號通路活性的抑制可激活PI3K/Akt通路，引起eNOS磷酸化而上調(diào)其活性［8］。因此，他汀類藥物可通過提高eNOS的表達水平及上調(diào)其活性2個方面增加肝臟NO釋放。但他汀類藥物增加肝硬化肝內(nèi)NO產(chǎn)量是否還涉及其它信號通路如p38 MAPK通路活性的改變，目前尚不清楚。

在本研究中，我們采用四氯化碳復(fù)合因素法構(gòu)建大鼠肝硬化門靜脈高壓癥模型，造模成功后給予辛伐他汀干預(yù)處理，干預(yù)結(jié)束，我們?nèi)〉昧艘幌盗袑嶒灲Y(jié)果。第一，與正常大鼠相比，肝硬化門靜脈高壓癥模型大鼠肝臟p38 MAPK信號通路發(fā)生了活化，這與 Deng 等［9］及 Tsukada等［10］的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)p38 MAPK信號通路活化參與了肝纖維形成。第二，辛伐他汀及 p38 MAPK特異性抑制劑SB203580均可明顯降低肝硬化門靜脈高壓癥模型大鼠PP，且辛伐他汀的降壓作用強于SB203580，對全身血流動力學無影響，這提示辛伐他汀降低肝硬化門靜脈壓力的機制除了與前述的RhoA/Rho激酶及PI3K/Akt通路活性改變相關(guān)外［4，8］，還可能涉及 p38 MAPK通路活性的抑制。第三，辛伐他汀及SB203580均可明顯降低肝硬化門靜脈高壓癥模型大鼠肝臟p38 MAPK通路活性，上調(diào)eNOS蛋白活性，增加肝臟內(nèi)NO產(chǎn)生，且辛伐他汀的作用強于SB203580，進一步提示辛伐他汀增加肝硬化大鼠肝臟NO的產(chǎn)量可能涉及多條信號通路活性的改變，其中包括p38 MAPK信號通路活性的抑制。第四，辛伐他汀及SB203580處理對肝硬化門靜脈高壓癥模型大鼠血清ALT、白蛋白等肝功能指標及肝臟組織學改變無明顯改善作用，此結(jié)果與Abraldes等［2］及Trebicka等［4］的報道相似。

總之，本研究提示，p38 MAPK信號通路活化參與了肝硬化模型大鼠門靜脈高壓癥的形成，辛伐他汀可降低其門靜脈壓力，其機制可能還涉及 p38 MAPK信號通路活性的抑制，進而上調(diào)eNOS活性，使肝臟NO產(chǎn)生增加，從而引起大鼠門靜脈壓力降低。

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