HPLC 法測(cè)定家兔模型腸梗阻后血漿中瓜氨酸含量

張春艷，董偉林，王潤(rùn)玲

（1.天津醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，天津 300270；2.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300070）

瓜氨酸是一種非蛋白質(zhì)α-氨基酸，是尿素-鳥氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，由腸上皮細(xì)胞通過谷氨酸-鳥氨酸途徑，從谷氨酰胺代謝中衍生而來[1]，小腸成為血液循環(huán)中瓜氨酸的主要來源。已有研究表明，腸梗阻后腸上皮細(xì)胞出現(xiàn)損害，血清和小腸組織中瓜氨酸水平可反映殘存的小腸上皮細(xì)胞數(shù)量，越低則說明損害越嚴(yán)重[2]。因此，血液及小腸組織中瓜氨酸濃度水平可作為研究腸梗阻嚴(yán)重程度或腸梗阻模型術(shù)前及術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)時(shí)的監(jiān)測(cè)手段。本試驗(yàn)建立了測(cè)定家兔模型腸梗阻后瓜氨酸含量的高效液相色譜法，該方法快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便，因此可作為血漿中瓜氨酸含量測(cè)定的方法，為后續(xù)試驗(yàn)比較不同藥物如大承氣湯、四君子湯對(duì)腸梗阻的治療效果提供了方法學(xué)指導(dǎo)[3-4]。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥品

1.1.1 儀器 日本島津高效液相色譜儀（SCL-6B色譜系統(tǒng)控制器、LC-6A 輸液泵、SPD-6AV 紫外檢測(cè)儀、Anastar 色譜工作站），MSB010.CX2.5 型離心機(jī)(U.K)，YKH-Ⅰ型液體快速混合器（江西醫(yī)療器械廠），KQ2200 超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器廠），AR2140 型電子分析天平（上海奧豪斯公司生產(chǎn)）。

1.1.2 試藥 瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（Alfa 公司提供，含量98%，批號(hào)：B2740A）；異硫氰酸苯酯：分析純（上海金山亭新化工試劑廠，含量99.5%，批號(hào)：080410）；甲醇：色譜純（天津市協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司，批號(hào)：20120328）；乙腈：色譜純（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20111205）；其他試劑為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasi1 C18（150 mm×Φ4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.072 mol·L-1的乙酸鈉水溶液∶甲醇∶乙腈=900∶75∶25（再加入10 mmol·L-1的EDTA 溶液125μL）；流速：0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫為常溫；進(jìn)樣量20μL。

1.2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制 精密稱取瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg 置于10 mL 棕色量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液（每1 mL含瓜氨酸1 mg，相當(dāng)于5.71 mmol·L-1）。

1.2.3 對(duì)照品溶液的配制 精密量取5.71 mmol·L-1的儲(chǔ)備液適量，分別置于10 mL 量瓶中，用蒸餾水稀釋定容，配制成含瓜氨酸5.71、28.54、57.08、114.16、285.40、570.81、1 141.62μmol·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻后備用。

1.2.4 樣品的處理 精密取家兔模型腸梗阻后不同時(shí)間血漿200μL，加200μL 乙腈，混勻，高速離心5 min，取上清液備用。

1.2.5 衍生化

1.2.5.1 衍生劑的配制：甲醇∶水∶無(wú)水乙醇∶三乙胺∶異硫氰酸苯酯=6∶1∶1∶1∶1，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.5.2 對(duì)照品溶液的衍生化：取對(duì)照品溶液50μL吹干，加入100μL 衍生劑，漩渦混勻1 min，在室溫下反應(yīng)15 min 后吹干；進(jìn)樣前用100μL 流動(dòng)相復(fù)溶。

1.2.5.3 供試品溶液的衍生化：取供試品經(jīng)處理后的上清液50μL 吹干，加入100μL 衍生劑，漩渦混勻1 min，在室溫下反應(yīng)15 min 后吹干，進(jìn)樣前用100μL 流動(dòng)相復(fù)溶。

1.2.5.4 空白的衍生化：直接取100μL 衍生試劑吹干，進(jìn)樣前用流動(dòng)相100μL 復(fù)溶。

1.2.6 專屬性試驗(yàn) 將衍生后的對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液分別進(jìn)樣，在上述色譜條件下分別測(cè)定，記錄色譜圖。

1.2.7 線性試驗(yàn) 分別吸取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化后進(jìn)樣20μL 分析，即得一系列色譜數(shù)據(jù)。以各自的峰面積為縱坐標(biāo)，以瓜氨酸的系列濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性分析。

1.2.8 精密度試驗(yàn) 取含瓜氨酸28.54、114.16、570.81μmol·L-l的對(duì)照品溶液分別衍生化后進(jìn)樣20μL，每間隔3 h 測(cè)定1 次，24 h 內(nèi)分別進(jìn)樣5 次，計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。按上述方法在1周內(nèi)連續(xù)5 d 進(jìn)樣，計(jì)算日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取含瓜氨酸285.40μmol·L-l的對(duì)照品溶液衍生化后進(jìn)樣20μL，24 h 內(nèi)分別進(jìn)樣6 次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份對(duì)照品溶液衍生化后連續(xù)測(cè)定6 次所得峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.11 回收率試驗(yàn) 精密吸取已測(cè)知含量的空白血漿50μL，分別加入瓜氨酸濃度為28.54、114.16、570.81μmol·L-l的3 種濃度的對(duì)照品溶液20μL，加入乙腈置于旋渦混合器上混勻，高速離心后取上清液吹干，加入200μL 衍生劑，混勻后在室溫下反應(yīng)15 min，吹干后用200μL 流動(dòng)相復(fù)溶，每個(gè)濃度分別進(jìn)樣3 次，計(jì)算得平均回收率。

2 結(jié)果

2.1 HPLC 色譜圖 由圖1 可知，瓜氨酸在22 min左右出峰，樣品在此保留時(shí)間也出現(xiàn)相同的峰。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按“1.2.7”條件測(cè)定，以瓜氨酸的峰面積為縱坐標(biāo)，以瓜氨酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=2 490.6x-26 068（r=0.999 1，n=3），瓜氨酸在5.71～1 141.62μmol·L-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，最低檢測(cè)限為0.57μmol·L-1。

2.3 穩(wěn)定性 取同一份對(duì)照品溶液衍生化后24 h內(nèi)測(cè)定6 次所得峰面積的平均值為671 815，RSD為0.95%，穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性 取同一份對(duì)照品溶液衍生化后連續(xù)測(cè)定6 次所得峰面積的平均值為670 817，RSD為0.67%，重復(fù)性較好。

2.5 精密度 低、中、高3個(gè)濃度對(duì)照品溶液衍生后的日間精密度和日內(nèi)精密度的結(jié)果為日間相對(duì)平均RSD為0.45%，日內(nèi)平均RSD為0.98%，總平均RSD<2%，重現(xiàn)性較好。

2.6 回收率 測(cè)定樣品的平均回收率為99.63%，平均RSD為0.74%。加樣回收結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)

2.7 樣品含量測(cè)定 取按“1.2.4”項(xiàng)處理的血漿樣品，經(jīng)衍生化后，測(cè)得的峰面積帶入回歸方程，取各時(shí)間段的平均值，結(jié)果顯示家兔模型腸梗阻24 h 后血漿中瓜氨酸含量（n=3）為40.18μmol·L-1，72 h 后血漿中瓜氨酸含量（n=3）為23.21μmol·L-1。

3 討論

3.1 測(cè)定方法的選擇 瓜氨酸在體液及組織中的含量水平是多種疾病檢測(cè)的重要指標(biāo)。已報(bào)道的瓜氨酸檢測(cè)方法有HPLC 法[5]、薄層掃描法[6]、酶法[7]等。薄層掃描法靈敏度不高，當(dāng)瓜氨酸濃度低于64.68 mmol·L-1時(shí)不能準(zhǔn)確檢出，故不能用于低濃度的瓜氨酸樣品測(cè)定。酶作用具有高度專一性，體液物質(zhì)的酶法測(cè)定受到很高的重視，但是由于酶法反應(yīng)條件難以控制，操作困難，故不宜使用。HPLC法靈敏度高、檢測(cè)限低，是一種理想的方法。

3.2 衍生試劑的選擇 本試驗(yàn)使用柱前衍生法檢測(cè)瓜氨酸含量，衍生試劑的選擇很重要。首先我們選擇常用于熒光檢測(cè)的鄰苯二甲醛（OPA）作為衍生試劑[8]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間及峰面積很不穩(wěn)定，且峰面積與濃度并不呈線性關(guān)系，故放棄此法。有文獻(xiàn)報(bào)道選用2，4-二硝基氟苯（DNFB）作為衍生劑[9]，DNFB 適用于仲胺的衍生，但衍生后會(huì)出現(xiàn)酰亞胺基副產(chǎn)物峰，難以與主峰分離，且DNFB 易發(fā)生水解作用，故也淘汰此法。PITC是測(cè)定氨基酸常用的衍生試劑，它的特點(diǎn)是在室溫下即可反應(yīng)，從而不必使用水浴，使試驗(yàn)更加容易操作，是一種理想的衍生試劑。

3.3 衍生溫度的影響 試驗(yàn)考察了衍生溫度為20.0℃、30.0℃、40.0℃對(duì)分析效果的影響，隨衍生溫度的升高，保留時(shí)間略延長(zhǎng)，峰面積減少，故最終確定最適溫度為20.0℃。

3.4 衍生劑量的影響 HPLC 法利用瓜氨酸與衍生化試劑反應(yīng)生成強(qiáng)紫外吸收的衍生物，在一定波長(zhǎng)下測(cè)定。因此，衍生劑的用量對(duì)瓜氨酸的分離度影響較大。試驗(yàn)考察了不同劑量的衍生劑對(duì)分離度的影響，衍生劑用量分別為50、100、150 和200μL。經(jīng)研究，隨著用量的增多，峰面積變化不大，但用量的增多會(huì)使成本比較高。另外發(fā)現(xiàn)，加入多于150μL的衍生劑后色譜圖的峰明顯增多，這是因?yàn)榻M織及血漿中含有多種氨基酸，有些氨基酸會(huì)和衍生劑發(fā)生反應(yīng)，干擾試驗(yàn)。綜合考慮以上因素，以衍生劑的用量為100μL 最宜。

3.5 衍生時(shí)間的影響 試驗(yàn)選擇不同衍生時(shí)間對(duì)分離度進(jìn)行考察，衍生時(shí)間分別為5、10、15、20、25 min。結(jié)果表明，衍生劑的衍生時(shí)間對(duì)瓜氨酸的檢測(cè)有較大影響，時(shí)間過長(zhǎng)或過短對(duì)峰面積的影響都比較大，綜合考慮時(shí)間、峰面積等因素，選擇衍生15 min為最佳衍生時(shí)間。

本試驗(yàn)得到了定量檢測(cè)瓜氨酸的HPLC 方法，并且通過對(duì)瓜氨酸的HPLC 分析研究，優(yōu)化得到了高效液相色譜法測(cè)定瓜氨酸的色譜條件。同時(shí)，試驗(yàn)也驗(yàn)證了HPLC 法檢測(cè)瓜氨酸靈敏可靠，分析迅速，準(zhǔn)確性高，具有較好的專屬性，適用于血藥濃度測(cè)定和藥動(dòng)學(xué)的研究。

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