青光眼藥物治療患者淚液中P 物質(zhì)的表達(dá)及與干眼癥發(fā)生率的相關(guān)性

李璐希，劉 偉，季 建

（天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院青光眼科，天津 300384）

青光眼是一類不可逆性致盲性眼病，藥物治療依然是醫(yī)生和患者首選的治療手段。許多研究證實(shí)[1-3]，抗青光眼藥物會(huì)對(duì)患者眼表的淚液所含的正常成分產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致眼部不適及干眼癥。而神經(jīng)肽P 物質(zhì)（substance P，SP）是主要由感覺(jué)神經(jīng)末梢分泌的一類神經(jīng)肽，屬于正常人淚液中的一種成分，它廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周身各組織器官，在很多細(xì)胞中質(zhì)量濃度都很豐富，如三叉神經(jīng)、視神經(jīng)等[4]，其中三叉神經(jīng)的感覺(jué)神經(jīng)支配著角膜。近期研究發(fā)現(xiàn)，SP 在某種程度上反映眼表器官中神經(jīng)肽的質(zhì)量濃度[1-2]，對(duì)組織愈合修復(fù)有著重要作用并對(duì)維持眼表微環(huán)境的穩(wěn)定發(fā)揮重要的作用[3]。但至今尚未有文獻(xiàn)報(bào)道青光眼藥物治療對(duì)患者淚液中SP 質(zhì)量濃度的影響及與干眼三者之間的聯(lián)系，本研究采用ELISA 檢測(cè)SP 在30例正常人和40例接受藥物治療青光眼患者淚液中的質(zhì)量濃度，從用藥時(shí)間和用藥種類上分析抗青光眼藥物對(duì)淚液中SP 濃度的影響，以及SP 質(zhì)量濃度與青光眼干眼癥發(fā)生率之間的相關(guān)性，探討藥物治療青光眼對(duì)SP的影響以及明確SP 在淚液和眼表中的作用與眼表疾病尤其是干眼的發(fā)病關(guān)系，以期為臨床藥物治療青光眼時(shí)對(duì)干眼的治療從病因及可能的發(fā)病機(jī)制方面提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 藥物治療組 天津醫(yī)科大學(xué)眼科中心確診為青光眼住院病人40例，年齡40～70 歲，平均年齡為52 歲。病例入選標(biāo)準(zhǔn)：眼壓≥21 mmHg；正在接受抗青光眼藥物治療的青光眼患者。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病患者；局部患有影響眼表功能的疾?。ㄈ绮€緣炎、淚囊炎、角結(jié)膜干燥綜合征、類天皰瘡等）；眼部手術(shù)史者；佩戴角膜接觸鏡史。其中在用藥時(shí)間上，大于3月組和小于等于3月組各20例眼；在用藥種類上，單獨(dú)用藥治療組10例，聯(lián)合兩種用藥治療組14例，聯(lián)合3 種用藥治療組16例。

1.1.2 對(duì)照組 無(wú)角膜接觸鏡佩戴史的健康自愿者30 眼，年齡38～67 歲，平均年齡為50 歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)干眼癥狀史、眼部疾病史、眼部手術(shù)史、戴角膜接觸鏡史、眼部過(guò)敏史、糖尿病史；Schirmer 試驗(yàn)>10 mm，淚膜破裂時(shí)間（breakuptime，BUT）＞10 s。

1.2 樣本采集 所有個(gè)體均進(jìn)食早餐，淚液于上午10:00-11:00，在相同條件下采集。用20μL 玻璃毛細(xì)管輕置于患者下結(jié)膜囊取淚液標(biāo)本5μL，采用加壓方法，注入50μL 0.9%生理鹽水Ep 管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SP 濃度的測(cè)定（ELISA 法）將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋20 倍。加入10μL 標(biāo)準(zhǔn)品和樣本于相應(yīng)反應(yīng)板孔中。每孔加入50μL Anti SP Biotin 和50μL SP POD，室溫溫育45 min，甩盡板內(nèi)液體，洗滌后每孔內(nèi)加入350μL 洗滌液及100μL 顯色液，室溫孵育20 min。每孔加入100μL 終止液，30 min內(nèi)在450 nm 處讀取OD 值。依樣本稀釋的比例還原成純淚液中SP 的質(zhì)量濃度。

1.4 干眼診斷標(biāo)準(zhǔn) 綜合考慮患者癥狀和臨床眼部客觀檢查結(jié)果，參考張梅等[5]的診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）眼表評(píng)分結(jié)果陽(yáng)性（包括了眼部癥狀和眼表活體染色的評(píng)分）；（2）SchirmerⅠ檢查值＜10 mm/min；（3）BUT檢查結(jié)果＜5 s。以上3 項(xiàng)結(jié)果均為陽(yáng)性者診斷為干眼癥。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s 表示，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，多個(gè)組的總體均數(shù)比較采用方差分析，組間率比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物治療組與正常組淚液SP 質(zhì)量濃度比較 正常組年齡（50.00±8.75）歲，藥物治療組年齡（52.00±9.06）歲，采用兩獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn)，t=0.927，P=0.36＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。40例接受藥物治療的青光眼患者及30例正常人淚液SP 質(zhì)量濃度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1?？梢钥闯鏊幬镏委熃M與正常人群相比，眼表淚液SP 質(zhì)量濃度降低（P<0.05）。

表1 SP 在藥物治療組與正常組淚液中的濃度（pg/mL，±s)Tab 1 SP concentration in the medication group and the normal group（pg/mL，±s)

表1 SP 在藥物治療組與正常組淚液中的濃度（pg/mL，±s)Tab 1 SP concentration in the medication group and the normal group（pg/mL，±s)

2.2 用藥時(shí)間對(duì)藥物治療組淚液SP 質(zhì)量濃度的影響 20例用藥時(shí)間≤3月組淚液SP 質(zhì)量濃度與20例用藥時(shí)間＞3月組淚液SP 質(zhì)量濃度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。采用兩獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn)，t=3.306，P＜0.05，兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可以看出用藥時(shí)間延長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致淚液SP 質(zhì)量濃度下降。

表2 用藥時(shí)間對(duì)藥物治療組淚液SP 質(zhì)量濃度的影響（pg/mL，±s)Tab 2 The effect of medication time on the SP concentration（pg/mL，±s)

表2 用藥時(shí)間對(duì)藥物治療組淚液SP 質(zhì)量濃度的影響（pg/mL，±s)Tab 2 The effect of medication time on the SP concentration（pg/mL，±s)

2.3 藥物種類數(shù)對(duì)藥物治療組淚液SP 質(zhì)量濃度的影響 單獨(dú)用藥組淚液SP 質(zhì)量濃度為（264.78±5.50）pg/mL，聯(lián)合兩種用藥組淚液SP 質(zhì)量濃度為（258.00±10.20）pg/mL，聯(lián)合3 種用藥組淚液SP質(zhì)量濃度為（254.16±6.85）pg/mL。采用方差檢驗(yàn)，F(xiàn)=5.518，P＜0.05，3 者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢钥闯鲇盟幏N類增加后，會(huì)導(dǎo)致淚液SP 質(zhì)量濃度降低。

2.4 藥物治療組淚液SP 質(zhì)量濃度與干眼之間的相關(guān)性 在40例藥物治療組患者中有25例被診斷為干眼，對(duì)藥物治療組淚液SP 質(zhì)量濃度（258.16±8.81）pg/mL 與干眼進(jìn)行Spearman 相關(guān)性檢驗(yàn)，r=-0.584，P＜0.05。可以認(rèn)為藥物治療組淚液SP 質(zhì)量濃度與干眼之間呈負(fù)相關(guān)。

2.5 用藥時(shí)間和聯(lián)合用藥數(shù)量與患者干眼之間的相關(guān)性 用藥時(shí)間長(zhǎng)短和聯(lián)合用藥數(shù)量與確診為干眼的眼數(shù)之間應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，所得結(jié)果分別為χ2=5.23，P＜0.05；χ2=6.601，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用藥時(shí)間長(zhǎng)短和聯(lián)合用藥數(shù)量與患者干眼發(fā)生率有關(guān)。見(jiàn)表3。

表3 用藥時(shí)間和聯(lián)合用藥數(shù)量與患者干眼之間的相關(guān)性Tab 3 Correlation of medication time and number with dry eye

3 討論

速激肽家族屬于一種神經(jīng)肽，是存在于脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物體內(nèi)的進(jìn)化保守的肽家族，由神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生無(wú)活性的前速激肽元在翻譯后加工成為不同的神經(jīng)肽。研究發(fā)現(xiàn)速激肽（tachykinins）在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中通過(guò)與G 蛋白耦聯(lián)的受體相互作用可以作為正常細(xì)胞的潛在生長(zhǎng)因子。而速激肽家族第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員是SP，1931年Von Euler 和Gaddum 在馬的小腸和腦中發(fā)現(xiàn)一種能引起腸平滑肌收縮和血壓下降的粉末狀物質(zhì)，由于當(dāng)時(shí)不知道其化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，于是按英文名稱的第一個(gè)字母命名為SP[6]。雖然早在1936年就已經(jīng)認(rèn)識(shí)到SP 是一種多肽物質(zhì)，但直到1970年才由Chang 等[7]從下丘腦中分離和純化了SP，進(jìn)而闡明了其結(jié)構(gòu)。

SP 廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中，研究發(fā)現(xiàn)，在正常角膜組織中，三叉神經(jīng)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)多分布在位于上皮下的淺基質(zhì)層內(nèi)，有研究采用免疫熒光法等技術(shù)觀察到在角膜上存在分泌SP 的神經(jīng)末梢[8-9]。在創(chuàng)傷后由感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放SP 到周圍組織中，成為神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控傷口愈合的重要介質(zhì)；還有文獻(xiàn)報(bào)道，它還參與了神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)淚液中不同的SP 質(zhì)量濃度關(guān)聯(lián)到一定程度的眼表功能失調(diào)[10]，例如在變應(yīng)性結(jié)膜炎和春季角膜結(jié)膜炎患者淚液中SP 質(zhì)量濃度明顯增加[11]，而角膜知覺(jué)減退眼和對(duì)側(cè)健眼相比SP 的質(zhì)量濃度是降低的，并且在糖尿病性角膜炎患者中SP 的質(zhì)量濃度比正常人亦降低[11]。那么SP在青光眼用藥以及干眼發(fā)生之間起著什么作用呢？

本研究采用ELISA 檢測(cè)SP 在正常人和接受藥物治療青光眼患者淚液中的質(zhì)量濃度并作比較，對(duì)照組淚液中SP 的質(zhì)量濃度和Yamadda 等[12]研究的正常人淚液中SP 的質(zhì)量濃度是一致的。結(jié)果表明接受藥物治療青光眼患者淚液中SP 的質(zhì)量濃度明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說(shuō)明對(duì)青光眼患者進(jìn)行藥物治療時(shí)，會(huì)降低其淚液中SP 的質(zhì)量濃度。我們還發(fā)現(xiàn)在用藥時(shí)間上，用藥時(shí)間大于3月組患者淚液中SP 的質(zhì)量濃度低于用藥時(shí)間小于等于3月組，這說(shuō)明隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)，藥物會(huì)降低淚液中SP 的質(zhì)量濃度；在用藥種類上，單獨(dú)用藥組的質(zhì)量濃度、聯(lián)合兩種用藥組的質(zhì)量濃度和聯(lián)合3 種用藥組的質(zhì)量濃度三者之間存在明顯的差異，可以看出隨著用藥種類的增加，SP 的質(zhì)量濃度會(huì)降低。而這種改變就可能與抗青光眼藥物治療的時(shí)間長(zhǎng)短、藥物種類有關(guān)。又有文獻(xiàn)報(bào)道長(zhǎng)期應(yīng)用0.25%噻嗎洛爾、0.25%倍他洛爾和0.1%地匹福林滴眼液會(huì)縮短淚膜的破裂時(shí)間，促進(jìn)結(jié)膜上皮細(xì)胞向鱗狀上皮轉(zhuǎn)化，引起眼干等不適癥狀[13-15]，從而降低青光眼患者生活質(zhì)量[15]。筆者推測(cè)由于局部抗青光眼藥物治療會(huì)對(duì)眼表淚液的正常分泌產(chǎn)生影響，抗青光眼藥物作用于眼表，藥物中添加的防腐劑可損害淚膜的脂質(zhì)層，導(dǎo)致淚膜穩(wěn)定性下降；同時(shí)，由于長(zhǎng)期用藥導(dǎo)致結(jié)膜杯狀細(xì)胞的損害，黏液分泌減少，進(jìn)一步引起B(yǎng)UT 縮短、淚液分泌減少；抗青光眼藥物也對(duì)結(jié)膜和角膜細(xì)胞產(chǎn)生毒性副作用，影響眼表三叉神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能，使角膜表面三叉神經(jīng)末梢數(shù)目減少，從而產(chǎn)生SP 減少，影響SP 的正常質(zhì)量濃度和功能的發(fā)揮，出現(xiàn)眼部不適和干眼癥。因此，接受抗青光眼藥物治療會(huì)導(dǎo)致淚液中SP 濃度的下降，并且一定程度上與眼表功能失調(diào)有密切關(guān)聯(lián)。

本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在藥物治療組患者中有25例被診斷為干眼，對(duì)藥物治療組淚液SP 質(zhì)量濃度與干眼進(jìn)行Spearman 相關(guān)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)藥物治療組淚液SP 質(zhì)量濃度與干眼之間呈負(fù)相關(guān)，即隨著淚液中SP 的降低就有可能會(huì)導(dǎo)致干眼發(fā)生率的升高，提示SP 對(duì)眼表可能發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)并具有穩(wěn)定眼表的作用。這與Nagano 等[16]研究發(fā)現(xiàn)相符，他們發(fā)現(xiàn)在去三叉神經(jīng)的神經(jīng)性角膜炎的動(dòng)物模型中看到淚液分泌降低，角膜敏感度喪失，上皮屏障功能損害，上皮傷口愈合延遲，用SP 和IGF-1 處理后提高了上皮屏障功能，刺激了角膜上皮傷口愈合。研究可以看出由三叉神經(jīng)末端釋放的SP 在角膜發(fā)揮了重要的營(yíng)養(yǎng)作用。由此筆者推測(cè)由于淚液分泌SP 減少，從而導(dǎo)致了淚膜穩(wěn)定性差，以致青光眼藥物治療時(shí)干眼發(fā)生率上升。在用藥時(shí)間和聯(lián)合用藥數(shù)量與患者干眼之間的相關(guān)性研究中筆者發(fā)現(xiàn)用藥時(shí)間和用藥種類與干眼發(fā)生率負(fù)相關(guān)，即用藥時(shí)間增加和用藥種類增多會(huì)導(dǎo)致干眼發(fā)生率的升高。

綜上，筆者認(rèn)為SP 和淚膜的穩(wěn)定有一定的關(guān)系，在用藥與干眼的發(fā)生之間都存在密切聯(lián)系。因此，當(dāng)確診為青光眼患者用藥時(shí)，應(yīng)關(guān)注藥物對(duì)眼表造成不適，當(dāng)藥物對(duì)眼部造成損傷[17]，出現(xiàn)眼部干燥不適時(shí)，在臨床用藥中應(yīng)控制好用藥時(shí)間和用藥的種類數(shù)，同時(shí)考慮點(diǎn)用含有SP 營(yíng)養(yǎng)的滴眼液，促進(jìn)組織修復(fù)同時(shí)改善眼部不適癥狀，提高青光眼患者生活質(zhì)量[18]。

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