煙曲霉與人肺上皮細胞中E－cadherin相結(jié)合蛋白的初步研究

徐小勇，王 玉，孫 禾，張鵬鵬，施 毅

煙曲霉（Aspergillusfumigatus）是自然界中廣泛存在的腐生微生物，也是一種非常重要的條件致病真菌。煙曲霉感染特別是侵襲性肺曲霉病預(yù)后差，即使正確的抗真菌治療后，病死率仍高達50%［1］。目前，對于煙曲霉具體致病機制仍知之甚少［2－3］。肺泡上皮細胞是侵襲性肺曲霉病致病的第一站，曲霉孢子是借助何種侵襲因子與上皮細胞接觸進而侵入宿主細胞目前仍未明確［4］。

病原體侵入宿主細胞的機制在產(chǎn)單核細胞李斯特菌（Listeriamonocytogenes）、白念珠菌等侵入上皮細胞過程中有充分的研究［5－9］。李斯特菌侵襲因子internalin A（Inl A）的胞外段以15個β－sheet形成半圓型結(jié)構(gòu)可以和上皮細胞黏附子E－cadherin的胞外結(jié)構(gòu)EC1結(jié)合，從而介導(dǎo)了李斯特菌黏附侵入上皮細胞。先前的研究表明，cadherin參與了煙曲霉黏附侵襲宿主細胞的過程，即煙曲霉中存在可以和人E－cadherin結(jié)合的蛋白序列［10－11］。本研究擬通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)方法對煙曲霉中與cadherin結(jié)合的侵襲因子進行初步探討。

材料與方法

一、煙曲霉中InlA相似序列的搜索

在PubMed上搜索李斯特菌的InlA氨基酸序列，記錄其中參與結(jié)合E－cadherin的功能域富亮氨酸重復(fù)序列（leucine－rich repeats，LRRs），以此序列在煙曲霉基因組（Af293）查詢相似序列（BLASTp）［12］。ExPASy Proteomics Server的Compute pI／Mw tool計算相關(guān)序列的相對分子質(zhì)量和等電點，分析一級結(jié)構(gòu)。

二、相似序列二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

應(yīng)用EXPASY（www.expasy.org／tools）上的PredictProtein（PHD，多重比對人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)比對預(yù)測結(jié)構(gòu)法）分析預(yù)測相似序列的二級結(jié)構(gòu)。

三、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

對同源性大于30%的蛋白上傳至SWISSMODEL服務(wù)器開展模型構(gòu)建工作，其他同源性不足的蛋白選擇Phyre（Successor of 3D－PSSM），用swiss－pdb viewer分析觀察模擬的三級結(jié)構(gòu)。

四、免疫共沉淀

煙曲霉標準株（AF293）由我院微生物室提供，生長于沙保弱培養(yǎng)基后5 d，滅菌磷酸緩沖液（PBS）沖洗獲取培養(yǎng)基表面的孢子，用16層紗布過濾，血球計數(shù)板計數(shù)后，用無血清DMEM培養(yǎng)液（Gibco）稀釋到107個／mL，4℃儲存?zhèn)溆谩＜兓娜薊－cadherin蛋白購自北京義楚神州生物技術(shù)公司（100μg）。離心沉淀煙曲霉孢子，充分裂解，加入純化E－cadherin 50μg，常規(guī)方法行免疫共沉淀，電泳分析其相對分子質(zhì)量。

結(jié)果

一、Inl A中LRR的氨基酸序列

LRR的氨基酸序列為：IDGLEYLNNLTQINFSNNQLTDITPLKULTKLVDILMNNNQIADITPLANSSNLTGLTLFNNQITDIDPLKNLTNLNRLELSSNTISDISALSGLTSLQQLSFGNQVTDLKPLANLTTLERLDISSNKVSDISVLAKLTNLESLIATNNQISDITPLGILTNLDELSLNGNQLKUIG。

以此序列在煙曲霉AF293中搜索相似序列，見表1。結(jié)合對相似序列的描述，選擇XP750927.1、XP750245.1、XP752100.1、XP748256.1進行進一步的分析。

相似序列一級結(jié)構(gòu)的分析，見表2。

表1 曲霉基因組中的Inl A同源序列Table 1 Homologous sequences with InlA in Aspergillus fumigatus genome

表2 相似蛋白的基本信息Table 2 Basic information of relevant proteins

二、相似序列二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

（一）XP750245.1的二級結(jié)構(gòu) 蛋白的H螺旋結(jié)構(gòu)占30.14%，β折疊占4.84%，無規(guī)則卷曲占65.02%。無穿膜序列及核定位序列。

（二）XP750927.1的二級結(jié)構(gòu) 蛋白的H螺旋結(jié)構(gòu)占9.63%，β折疊占7.98%，無規(guī)則卷曲占82.39%。無穿膜序列及核定位序列。

（三）XP752100.1的二級結(jié)構(gòu) 蛋白的H螺旋結(jié)構(gòu)占25%，β折疊占6.53%，無規(guī)則卷曲占68.47%。無穿膜序列及核定位序列。

（四）XP748256.1的二級結(jié)構(gòu) 蛋白的H螺旋結(jié)構(gòu)占40.98%，β折疊占17.32%，無規(guī)則卷曲占41.71%。預(yù)測7個穿膜序列，最高評分為0.893 1，為第239－257氨基酸殘基。最高Zscore＝1.287。無核定位序列。

（五）三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測 通過將上述4蛋白的序列提交給SWISS－MODEL（同源重建）和Phyre服務(wù)器。XP750927.1和XP750245.1同源性較好采用swiss－model的同源重建，其余提交Phyre服務(wù)器，獲得三維結(jié)構(gòu)，見圖1。提示XP752100.1、XP748256.1與InlA三維結(jié)構(gòu)類似。

圖1 煙曲霉中與InlA相似蛋白的三級結(jié)構(gòu)模擬圖Figure 1 The diagram of the tertiary structure of the proteins in Aspergillus fumigatus which are similar to Inl A

三、免疫共沉淀

煙曲霉蛋白組與人重組E－cadherin行免疫共沉淀，分離蛋白后行電泳分析。提示與E－cadherin結(jié)合的蛋白出現(xiàn)在43×103～55×103，見圖2，箭頭所示。

圖2 煙曲霉中與E－cadherin可結(jié)合蛋白電泳圖Figure 2 The protein binding to E－cadherin in Aspergillus fumigatus

在43×103～55×103區(qū)間存在一淡色條帶，箭頭所示，對照組缺失，提示在煙曲霉中存在此區(qū)間蛋白可以和人重組E－cadherin結(jié)合。

討 論

煙曲霉孢子直徑2～3μm，懸浮于空氣中而易被宿主吸入到肺泡中，在宿主免疫力低下時，孢子躲避了肺泡巨噬細胞的吞噬而進入肺泡上皮細胞內(nèi)，進而可發(fā)育成菌絲，侵襲性生長乃至全身播散。孢子進入肺泡上皮細胞是侵襲性肺曲霉病致病的第一步，研究其侵襲機制，特別是分子機制，針對特定靶位涉及藥物可降低侵襲性肺曲霉病的病死率。

大規(guī)模高通量測序技術(shù)的進步帶來了生物信息學(xué)快速發(fā)展，使生物信息學(xué)深入到各項生命科學(xué)研究中。在生物信息學(xué)的推動下，可以迅速了解蛋白質(zhì)甚至是病原體和宿主相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，推測出新的蛋白質(zhì)相互作用［13－14］。蛋白質(zhì)相互作用一般是通過特定的、較為保守的結(jié)構(gòu)域完成，我們通過十分明確的李斯特菌InlA與上皮細胞E－cadherin相互作用機制推測煙曲霉中可能與cadherin結(jié)合的蛋白配體，并通過簡單易行的蛋白質(zhì)相互作用實驗來初步探討cadherin的配體。免疫共沉淀的方法初步表明，煙曲霉中與上皮細胞E－cadherin的蛋白相對分子質(zhì)量為50×103，與生物信息學(xué)推測的XP748256.1相對分子質(zhì)量類似，并有穿膜序列，表明了XP748256.1有可能為人肺泡上皮細胞E－cadherin的配體。從質(zhì)量上分析，我們預(yù)測的蛋白與實際的蛋白質(zhì)量上有一定的誤差，這可能由于蛋白合成后存在糖化或其他的一些修飾反應(yīng)而導(dǎo)致質(zhì)量的變化。另外，電泳中的不規(guī)則遷移也可導(dǎo)致測定的質(zhì)量發(fā)生誤差，但誤差一般不超過30%［15］，而我們目標蛋白恰在誤差范圍內(nèi)。當然，最終蛋白的測定還需要質(zhì)譜等檢測來分析，并通過進一步的分子生物學(xué)的實驗證實其作用。

絕大多數(shù)蛋白質(zhì)現(xiàn)在還不能通過X線晶體衍射或磁共振來測定結(jié)構(gòu)，因此需要通過生物信息學(xué)的預(yù)測方法來推斷蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)［16－17］。同源建模是最常用的建模方法［18］，但只有當目標研究蛋白的同源性在30%以上時結(jié)果才相對可靠。對同源性在30%以下的蛋白，THREADING預(yù)測法是近年發(fā)展起來的一種新方法［19］，我們選擇基于此的Phyre對未知蛋白進行預(yù)測［20］。其主要原理是把未知蛋白質(zhì)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中已明確的蛋白質(zhì)折疊進行比對，選擇最好的模型進行構(gòu)建。

總之，通過初步的生物信息學(xué)和分子生物學(xué)推測，cadherin在煙曲霉蛋白XP748256.1可能為E－cadherin相關(guān)的結(jié)合蛋白，但需進一步的分子生物學(xué)技術(shù)來論證。

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