黃芩苷對神經病理性疼痛模型大鼠機械性痛覺超敏的影響

冀潔 宋華園 戴文玲 周丹麗 韓園 劉文濤

神經病理性疼痛是由神經系統原發(fā)或繼發(fā)性損害或功能障礙所引起的慢性疼痛。其發(fā)病機制和有效治療一直是科研熱點和難點。

黃芩是一味傳統的清熱解毒中藥, 其有效成分為黃酮類。黃芩苷是從黃芩中提取并鑒定出的最主要的活性成分之一。藥理學實驗研究證實［1］黃芩苷具有抗菌, 抗炎, 抗氧化,鎮(zhèn)靜, 及心血管和腦損傷保護作用等多種藥理作用。有研究顯示, 黃芩提取物可抑制LPS誘發(fā)的小膠質細胞活化并降低炎癥因子的釋放［2,3］。小膠質細胞的異?；罨驯蛔C明在神經病理性疼痛中發(fā)揮了重要作用［4］。

黃芩苷對神經病理性疼痛的治療作用的研究尚未見報道。本研究制備大鼠坐骨神經慢性壓迫模型(chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI), 利用Von Frey法考察黃芩苷對神經損傷造成的機械性痛覺超敏的治療作用。

1 材料

1. 1 藥物 黃芩苷, 純度95%, 購于南京澤朗植提技術有限公司。鹽酸嗎啡, 購自沈陽第一制藥廠。

1. 2 動物 健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠, 體重為180～220 g, 由浙江省實驗動物中心提供, 生產許可證號：SCXK(浙 )2008-0033。

1. 3 Von Frey測痛包(美國DanMic Global公司)。

2 方法與結果

2. 1 數據統計 結果均以(±s)表示, 用SPSS 11.5分析軟件進行組間t檢驗, 以P<0.05為差異有統計學意義。

2. 2 神經病理性疼痛大鼠模型的建立 通過寬松結扎大鼠坐骨神經制備CCI神經病理性疼痛模型。以Von Frey法測定機械刺激縮足反射閾值(Mechanical withdrawal threshold,MWT), 術后7 d MWT較基礎痛閾下降40%以上者視為CCI模型成功, 可以進行后續(xù)實驗。

MWT測定：手術前和手術后3、7、10和14 d分別測量機械痛閾值, 評價造模前后的機械性痛覺超敏情況。結果如圖一所示, 手術前兩組大鼠的MWT無統計學差異。CCI造模以后, 與正常組(Control)相比, 手術組(Model)大鼠的MWT在各個時間點均顯著縮短(P< 0.01), 并在術后第7天數值達到平臺期, 較基礎痛閾下降約50 %(P<0.01, 見圖1)。結果表明手術誘發(fā)了大鼠的機械性痛覺超敏, CCI模型成功。

圖1 CCI手術對SD大鼠機械刺激縮足反射閾值的影響(±s, n = 6)

2. 3 黃芩苷對正常大鼠機械刺激縮足反射閾值的影響 正常SD大鼠18只, 分為溶媒組和黃芩苷組。黃芩苷組分為10 μg/只和20 μg/只兩個不同劑量組, 每組6只。給藥方式為椎管內給藥, 給藥體積為20 μl/只。溶媒組椎管內注射等體積的0.05%的 DMSO, 。測定給藥前0 h和給藥后1 h, 2 h, 4 h,8 h和24 h的MWT。

結果可見, 黃芩苷兩個不同劑量對大鼠的MWT均無顯著性影響(P>0.05, 見圖2)。結果表明, 黃芩苷在10 μg/只的劑量下, 對基礎機械學痛覺閾值沒有影響。

圖2 黃芩苷對正常大鼠機械刺激縮足反射閾值的影響( ±s, n = 6)

2. 4 黃芩苷對CCI大鼠機械刺激縮足反射閾值的影響 篩選CCI造模成功的大鼠, 于手術后第14天開始給藥。分CCI模型組, 嗎啡組和黃芩苷治療組。黃芩苷組分為10 μg/只和20 μg/只兩個不同劑量組, 給藥方式為椎管內給藥, 每組6只。測定給藥前0 h和給藥后1 h, 2 h, 4 h, 8 h和24 h的MWT。嗎啡組椎管內注射一次鹽酸嗎啡, 劑量為10 μg/只, CCI模型組則注射相同體積生理鹽水, 嗎啡組和模型組行為學測定方法同黃芩苷治療組。見圖3。

結果可見, 與模型組比較, 黃芩苷兩個不同劑量單次給藥后均具有顯著的鎮(zhèn)痛作用, 且具有劑量相關性(P<0.05), 同時作用時間維持較長, 鎮(zhèn)痛作用大于8 h。而嗎啡給藥2 h后,即沒有顯著鎮(zhèn)痛作用。結果表明：黃芩苷可顯著抑制CCI導致的大鼠機械性痛覺超敏, 且鎮(zhèn)痛作用維持時間較長。

圖3 黃芩苷對CCI神經病理性疼痛模型機械刺激縮足反射閾值的影響(±s, n = 6)

3 討論

越來越多的研究表明: 膠質細胞的激活包括小膠質細胞的異常激活在神經病理性疼痛中發(fā)揮著重要作用［4］。神經損傷可以導致脊髓水平的小膠質細胞細胞異常激活。小膠質細胞激活后, 產生大量細胞因子、炎性介質和神經活性物質, 進而增強脊髓背角神經元的興奮性, 如ROS、NO、PGs、EAAs、ATP、花生四烯酸、TNF、神經生長因子、白細胞介素等。過量的這些物質積聚在脊髓背角, 使病理性疼痛進一步發(fā)展和持續(xù)。通過抑制膠質細胞激活, 可阻斷這一系列病程的發(fā)生與發(fā)展。

有研究顯示, 黃芩提取物可通過抑制NO的生成以及抑制小膠質細胞的COX2的表達, 進而顯著抑制LPS誘發(fā)的小膠質細胞活化, 并抑制前炎性細胞因IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放。而神經損傷后, 脊髓水平活化的小膠質細胞釋放的IL-1β、IL-6、TNF-α對病理性疼痛的發(fā)生和持續(xù)起著重要作用, 利用針對它們的中和性抗體可以顯著抑制CCI導致的機械學超敏［5,6］。同時有文獻報道黃芩苷在體內的代謝物可通過血腦屏障進入中樞神經系統, 發(fā)揮神經保護效應［7］。

正是由于黃芩苷具有以上特點, 作者推測黃芩苷可能對神經損傷導致的小膠質細胞異?；罨幸种谱饔?。利用小膠質細胞的抑制劑可以抑制神經損傷導致的機械性痛覺超敏,所以作者首先研究了黃芩苷對CCI導致的機械性痛覺超敏的影響。

本研究首次發(fā)現,黃芩苷可以顯著抑制CCI導致的大鼠機械性痛覺超敏。作者推測其作用機制可能與抑制脊髓水平的小膠質細胞活化有關。同時作者的研究還發(fā)現, 兩個不同劑量的黃芩苷均不影響正常大鼠的基礎機械學痛閾, 說明黃芩苷對脊髓水平的正常傷害性感受信息調制沒有顯著影響。

嗎啡類藥物被廣泛應用于治療神經病理性疼痛。但是嗎啡的鎮(zhèn)痛作用持續(xù)時間較短, 為了有效控制疼痛, 需要持續(xù)大劑量給藥。而這將會帶來成癮, 耐受和胃腸道反應等副作用, 極大地限制了嗎啡的臨床應用。作者的數據表明,黃芩苷雖然在相同劑量下的鎮(zhèn)痛效率上不如嗎啡, 但是其鎮(zhèn)痛持續(xù)時間優(yōu)于嗎啡。20 μg黃芩苷的鎮(zhèn)痛持續(xù)時間>8 h,是10 μg嗎啡的2倍以上。這表明了以黃芩苷作為先導化合物研發(fā)新的治療神經病理性疼痛的藥物, 具有較大潛力。

綜上所述, 本文首次證實了黃芩苷對神經病理性疼痛進程中機械性痛覺超敏的治療作用, 并發(fā)現了其鎮(zhèn)痛持續(xù)時間優(yōu)于嗎啡。但是黃芩苷通過何種分子機制發(fā)揮治療神經病理性疼痛的作用, 仍需更深層次的研究和探討。

［1］ 馮友根．鄒曉華．國內黃芩苷藥理作用研究與臨床應用概述．中國醫(yī)藥情報, 2004, 10(2): 35-43．

［2］ Chen CJ, Raung SL, Liao SL, et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase expression by baicalein in endotoxin/cytokinestimulated microglia. Biochem Pharmacol.Biochem Pharmacol,2004, 67(5): 957-965.

［3］ Woo KJ, Lim JH, Suh SI, et al. Differential inhibitory effects of baicalein and baicalin on LPS-induced cyclooxygenase-2 expression through inhibition of C/EBPbeta DNA-binding activity.Immunobiology. Immunobiology, 2006, 211(5): 359-368.

［4］ Ji RR, Berta T, Nedergaard M. Glia and pain: is chronic pain a gliopathy. Pain, 2013.

［5］ Gao YJ, Zhang L, Samad OA, et al. JNK-induced MCP-1 production in spinal cord astrocytes contributes to central sensitization and neuropathic pain. J Neurosci, 2009, 29(13): 4096-4108.

［6］ Kawasaki Y, Xu ZZ, Wang X, et al. Distinct roles of matrix metalloproteases in the early- and late-phase development of neuropathic pain. Nat Med, 2008, 14(3): 331-336.

［7］ Tarragó T, Kichik N, Claasen B, et al. Baicalin, a prodrug able to reach the CNS, is a prolyl oligopeptidase inhibitor. Bioorg Med Chem. Bioorg Med Chem, 2008, 16(15): 7516-7524.