RP-HPLC法同時測定夏桑菊顆粒中綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷

林麗美，夏伯候，劉菊妍，李 春，何迎春，姚江雄，許招懂，梁 航，廖端芳*

(1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙 410208;2.湖南省中藥不良成分快速檢測及脫除工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410208;3.廣州醫(yī)藥集團有限公司，廣東廣州 510130;4.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700;5.廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司，廣東廣州 510288)

夏桑菊顆粒為夏枯草、桑葉、野菊花三味藥材經(jīng)加工制成，商品規(guī)格20袋/包，10 g/袋，具有清熱解毒，清肝明目之功效。常用于風熱感冒，目赤頭痛，高血壓等癥。夏桑菊顆粒質(zhì)量標準停留在部頒標準層次，該標準僅收錄了該藥品的處方、制法、性狀、鑒別、檢查、主治與功能、用量與用法、規(guī)格和貯藏九個項目，缺乏含量測定項［1］，導致市場上夏桑菊顆粒質(zhì)量參差不齊，人民健康受到威脅。對于夏桑菊顆粒的君藥夏枯草，研究相對較多。目前已有采用紫外-可見分光光度法和HPLC對夏枯草中迷迭香酸量進行了測定［2-4］，且對其降血壓、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗病毒等藥理作用進行了較多研究［5-7］。本課題組前期對夏桑菊顆粒開展了指紋圖譜研究［8-9］，同時參考2010年版《中國藥典》選擇夏枯草測定指標迷迭香酸和野菊花測定指標蒙花苷作為夏桑菊顆粒成分定量測定的兩個質(zhì)量控制成分［10-11］，但是非同步測定?；诖?，本課題組在前期工作基礎(chǔ)之上，同步測定迷迭香酸和蒙花苷的同時，增加了夏枯草果穗的特征成分異迷迭香酸苷［12］和三味藥材共有成分綠原酸的定量測定。通過開展該研究，為夏桑菊顆粒的質(zhì)量標準提高提供參考和借鑒，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 KQ-100B型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);BPZ11D型電子分析天平(Sartorius公司);Waters2695-2996高效液相色譜系統(tǒng)，Empower工作站，含四元梯度泵、自動進樣器(Waters公司)。

1.2 試劑 甲醇(色譜純，TEDIA公司)，乙腈(色譜純，TEDIA公司)，水為哇哈哈純凈水，冰乙酸(色譜純，北京化工廠)。

1.3 對照品及樣品 對照品綠原酸［13］、異迷迭香酸苷［12］和迷迭香酸［12，14］(本課題組自制，純度大于98%)，蒙花苷(批號:111528-200202，中國藥品生物制品檢定所)，4種對照品的具體結(jié)構(gòu)式見圖1～4);夏桑菊顆粒由廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司提供。

圖1 綠原酸Fig.1 Chlorogenic acid

圖2 異迷迭香酸苷Fig.2 Salviaflaside

圖3 迷迭香酸Fig.3 Rosmarinic acid

圖4 蒙花苷Fig.4 Linarin

2 HPLC測定

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm);體積流量 1.0 mL/min;檢測波長320 nm;柱溫30℃;樣品溫度20℃;進樣體積10μL;流動相為乙腈(A)-1.0%醋酸水(B)梯度洗脫，洗脫程序為0→40 min，10%A→30%A。按照上述色譜條件，待測成分綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷分離很好，無干擾，見圖5。

圖5 對照品(A)和夏桑菊顆粒(B)高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and Xiasangju Granules(B)

2.2 供試品溶液制備 稱取夏桑菊顆粒及相應(yīng)的陰性樣品約2.5 g，精密稱定，加甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲 30 min(功率 250 W，頻率 40 kHz)，取出，靜置，放涼，補足失質(zhì)量，0.22μm微孔濾膜濾過，HPLC分析。

2.3 標準曲線的繪制 分別精密稱取綠原酸、迷迭香酸和蒙花苷對照品適量，用甲醇溶解，定容，得到質(zhì)量濃度分別為0.0389μg/μL、0.0480μg/μL和0.0386μg/μL 的對照品溶液。精密稱取異迷迭香酸苷適量，配置成質(zhì)量濃度為0.2104μg/μL，再稀釋為 0.033664μg/μL 和0.006733μg/μL的對照品溶液。

分別精密吸取綠原酸、迷迭香酸和蒙花苷對照品溶液 1、3、5、8、10、15和 20μL進樣分析，記錄按上述色譜條件測定的峰面積。分別精密吸取質(zhì)量濃度為0.2104μg/μL的異迷迭香酸苷對照品溶液2、5、10、15、20μL;質(zhì)量濃度為0.033664μg/μL的異迷迭香酸苷對照品溶液1、2、5、10、15、20μL;質(zhì)量濃度為0.006733μg/μL 的異迷迭香酸苷對照品溶液 1、2、3、5、10、15、20μL，記錄按上述色譜條件測定的峰面積。以峰面積為縱坐標，進樣體積為橫坐標，得綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的線性回歸方程分別為:Y=182283X－131274(r=0.9994，0.0389～ 0.7771μg)、Y=9109021 X － 32842(r=0.9999，0.0067 ～ 4.200μg)、Y=178507 X －142821(r=0.9992，0.0480 ～0.9600μg)和 Y=99764 X－73510(r=0.9992，0.0386～0.7714μg)。

2.4 精密度試驗 分別精密吸取上述配制好的同一對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，按上述色譜條件測定綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的峰面積，其 RSD分別為0.18%、0.53%、0.44%和0.49%。

2.5 穩(wěn)定性試驗 分別精密吸取同一供試品溶液(批號 JA10123)10μL，分別在 2、4、6、8、10、12、24 h進樣，按上述色譜條件測定綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的峰面積，其RSD分別為1.21%、1.52%、0.88%和0.91%。

2.6 重復性試驗 取同一份樣品(批號JA10123)6份，精密稱定，制備供試品溶液，按上述色譜條件測定綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的峰面積，其 RSD分別為 1.43%、0.99%、1.18%和1.11%。

2.7 回收率試驗 取同一批已知含有量的夏桑菊顆粒樣品(批號JA10123)約1.25 g，精密稱定，分別精密加入一定量綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷對照品溶液，按2.2項制成加樣供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

2.8 樣品測定 按照上述色譜條件，將不同廠家的樣品進行處理和進樣，每一個相同廠家及批號的樣品測3份，采用外標兩點法計算夏桑菊顆粒中綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的平均含有量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 4個指標成分均為酚酸或黃酮，在甲醇中有較好的溶解度，選擇甲醇超聲，處理容易、可控;且樣品呈酸性，選擇醋酸水溶液作為水相，水相中醋酸比例是通過單因素多水平試驗確定最佳比例為1.0%。選擇乙腈作為有機相來分析中藥復方，柱壓穩(wěn)定且較低，有利于保護儀器和色譜柱。波長選擇320 nm也是基于所測化合物在該波長處均有明顯吸收，且雜質(zhì)干擾較少。梯度選擇均一梯度變化以保證樣品具有更好的重復性。

表2 樣品測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Results of sample assay(n=3)

3.2 測定結(jié)果表明，相同廠家夏桑菊顆粒4種活性成分綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的含有量相對穩(wěn)定，不同廠家之間4種成分含有量差別極大，甚至有大部分廠家的樣品中不能夠同時測出4種活性成分，說明含某(幾)種活性成分的量極低甚至沒有?？梢姡忻嫔狭魍ǖ牟煌瑥S家夏桑菊顆粒質(zhì)量極不一致。為了促進名優(yōu)大品種的發(fā)展、維護優(yōu)勢合法企業(yè)和保障人民健康用藥，提高夏桑菊顆粒質(zhì)量標準迫在眉睫。同時建議質(zhì)量標準中綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷4種活性成分的含有量下限分別為 1.50、0.20、2.00和1.00 mg/袋。

中藥質(zhì)量標準是一個復雜艱巨體系［15］，但其重要性激勵著科研工作者不斷的探索和創(chuàng)新［16-17］。建立和提高夏桑菊顆粒的質(zhì)量標準是為了將假藥和劣藥攔在流通大門之外，而目前以假亂真、以次充好的技術(shù)是與時俱進的，因此質(zhì)量標準的建立與完善也是與時俱進的。本課題組接下來將從特征圖譜和指紋圖譜方面繼續(xù)研究夏桑菊顆粒的質(zhì)量標準，為建立夏桑菊顆粒的質(zhì)量標準體系提供參考，達到有效控制夏桑菊顆粒質(zhì)量之目的。

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