莪術(shù)油誘導(dǎo)卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞凋亡及對(duì)STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響

李榮霞，劉首娟，孔德勝，李 敏，李艷芳，史淑紅，

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北石家莊 050000)

莪術(shù)油是從姜科植物莪術(shù)的干燥根莖中提取的揮發(fā)油成分，味辛、苦，性溫，歸肝、脾經(jīng)，具有破血行氣、消積止痛之功。莪術(shù)中富含揮發(fā)油，且成分相當(dāng)復(fù)雜，主要化學(xué)成分為β-香烯、莪術(shù)醇、莪術(shù)酮、新莪術(shù)二酮、樟腦和異莪術(shù)醇等［1］。其具有很好的抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗血栓形成和增強(qiáng)免疫功能等［2-4］廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，尤其是其抗腫瘤作用受到廣泛關(guān)注。楊美春等［5］研究表明，莪術(shù)油對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞具有增殖抑制作用。但對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞株是否有作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

信號(hào)傳導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的化療藥物有關(guān)，Rosen等［6］發(fā)現(xiàn)STAT3和Bcl-xl高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞系SKOV3對(duì)順鉑不敏感，而STAT3低表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780對(duì)化療藥物敏感，實(shí)驗(yàn)表明:腫瘤細(xì)胞中STAT3高表達(dá)于化療耐藥有關(guān)。Gu等［7］研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中STAT3異常高表達(dá)與順鉑化療耐藥相關(guān)，并通過(guò)體外研究發(fā)現(xiàn)阻斷STAT3信號(hào)通路可恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑化療的敏感性。抑制STAT3信號(hào)通路可以使耐藥腫瘤細(xì)胞增敏，STAT3通路及其調(diào)控的下游靶基因可以作為腫瘤對(duì)化療耐藥的標(biāo)志［8-12］。實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)將莪術(shù)油作用 SKOV3/DDP評(píng)估其抗腫瘤作用，并初步探討其對(duì)STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，為耐藥性卵巢癌的臨床治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞系SKOV3/DDP購(gòu)自上海生物工程公司。該細(xì)胞系耐藥倍數(shù)是親代株的4.3倍，此細(xì)胞系在加藥凍存及連續(xù)無(wú)藥培養(yǎng)條件下可分別保持3個(gè)月及6個(gè)月的穩(wěn)定耐藥性。

1.1.2 主要藥物及試劑 莪術(shù)油注射液(徐州萊恩藥業(yè)有限公司，規(guī)格:10 mL/支:莪術(shù)油0.1 g/支，國(guó)藥準(zhǔn)字H20067076);順鉑(山東齊魯制藥廠，規(guī)格:10 mg/支，國(guó)藥準(zhǔn)字H37021358);青霉素、鏈霉素(華北制藥股份有限公司);RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物制品公司);Actived Caspase-3抗體、STAT3抗體、兔抗人Survivin抗體(Bioworld公司產(chǎn)品);山羊抗兔IgG抗體、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);噻唑藍(lán)(美國(guó)Sigma公司);RNA提取試劑盒(Invitrogen公司);引物(賽百盛公司)。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器公司);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);臺(tái)式離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司);酶標(biāo)儀MN3型(Labsystems Dragon Well Scan);倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS);數(shù)碼相機(jī)(日本 OLYMPUS)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SKOV3/DDP細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1μg/mL順鉑、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h換液1次，約3～5 d經(jīng)0.4%胰蛋白酶消化以1∶3的比例傳代。順鉑用生理鹽水配成20μg/mL貯存液，－20℃保存，使用時(shí)需要用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成工作液。

莪術(shù)油作用于 SKOV3/DDP細(xì)胞的IC30為37μg/mL之間，順鉑作用于SKOV3/DDP細(xì)胞的IC30在10與20μg/mL之間，預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示莪術(shù)油與順鉑聯(lián)用具有協(xié)同作用，依據(jù)文獻(xiàn)選用15μg/mL［13］。

1.2.2 MTT法測(cè)定SKOV3/DDP細(xì)胞的增殖活性

將細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL接種于96孔板，待細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后吸去培養(yǎng)液，分別加入含10%胎牛血清RPM11640配制的質(zhì)量濃度為0、16、32、64、128、256μg/mL 莪術(shù)油 0.2 mL/孔，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔;分別培養(yǎng)24、48 h后棄上清，加入5 mg/mL的MTT(PBS液配制)20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，各孔加入0.15 mL DMSO，振搖10 min，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔吸光度D490的值，并記錄結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=［1－(實(shí)驗(yàn)孔 D490值 －空白孔 D490值)/(對(duì)照孔D490值 －空白孔D490值)］×100%

1.2.3 免疫組化法 將蓋玻片放入12孔板中，然后將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以5×104mL接種到12孔板中，待24 h細(xì)胞貼壁后，按15μg/mL順鉑、37μg/mL 莪術(shù)油、15μg/mL 順鉑聯(lián)合 37μg/mL莪術(shù)油加入到12孔板中，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。培養(yǎng)24 h后，丙酮固定30 min，實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)［15］。使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析400倍所拍的照片，分析前進(jìn)行陽(yáng)性目標(biāo)的彩色分割、編輯，得到滿意圖形圖像后，選擇相應(yīng)的區(qū)域，測(cè)量其積分光密度(IOD)及測(cè)量面積，以IOD值除以測(cè)量面積，計(jì)算平均光密度(mean density)，高倍鏡下選取10個(gè)視野，每張片子計(jì)算10次平均光密度值。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)莪術(shù)油對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞STAT3及其下游靶基因的表達(dá)情況 參照NCBIGeneBank的基因序列，運(yùn)用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)表1)。具體過(guò)程參考文獻(xiàn)［16］，擴(kuò)增條件見(jiàn)表2，取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，UVP紫外凝膠分析系統(tǒng)攝像，利用Quantity one圖象分析軟件行灰度值分析并保存結(jié)果。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

表2 反應(yīng)條件Tab.2 PCR reaction conditions

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算P值。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析和非參數(shù)檢驗(yàn))，數(shù)據(jù)以表示，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)莪術(shù)油對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞增殖抑制情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示16、32、64、128、256μg/mL莪術(shù)油作用于卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞后，隨藥物質(zhì)量濃度增加，其對(duì)細(xì)胞有明顯的抑制作用且呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間-劑量關(guān)系。藥物作用24 h后，抑制率分別為 13.9%、24.6%、59.7%、86.0%、96.2%;作用 48h抑制率分別為21.77%、29.72%、49.04%、54.67%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示對(duì)照組與各質(zhì)量濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表3、圖1。

表3 不同質(zhì)量濃度莪術(shù)油對(duì)SKOV3/DDP的增殖抑制率()Tab.3 Inhibition rates of the different concentrations of Zedoary Oil to the SKOV3/DDP cells()

表3 不同質(zhì)量濃度莪術(shù)油對(duì)SKOV3/DDP的增殖抑制率()Tab.3 Inhibition rates of the different concentrations of Zedoary Oil to the SKOV3/DDP cells()

注:不同質(zhì)量濃度莪術(shù)油作用于SKOV3/DDP吸光度值比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

藥物質(zhì)量濃度/(μg·mL－1 24 h 48 h)光密度值 增殖抑制率 光密度值 增殖抑制率0(對(duì)照組)0.173±0.008 0.201±0.00716 0.160±0.002 0.139* 0.171±0.005 0.205*32 0.149±0.006 0.246* 0.152±0.003 0.336*64 0.116 ±0.004 0.597* 0.104 ±0.003 0.662＊＊128 0.091 ±0.004 0.860＊＊ 0.072 ±0.002 0.882＊＊256 0.082±0.003 0.962* 0.059±0.001 0.976*

2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 表4及圖3示，終質(zhì)量濃度為15μg/mL順鉑，39μg/mL莪術(shù)油，及其二者聯(lián)合作用于卵巢上皮細(xì)胞癌SKOV3/DPP檢測(cè)結(jié)果顯示STAT3各組的表達(dá)有差異，Survivin結(jié)果顯示各組間比較有差異，各組間表達(dá)有差異，Caspase-3各組間表達(dá)有區(qū)別。均為P＜0.01差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Spearman相關(guān)系數(shù)分析SKOV3/DPP細(xì)胞中STAT3與Survivin蛋白的相關(guān)系數(shù)為0.883，P=0.000＜0.01，呈正相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;STAT3與 Caspase-3蛋白的相關(guān)系數(shù)為 －0.878，P=0.000＜0.01，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 不同質(zhì)量濃度莪術(shù)油作用SKOV3/DDP 48 h后細(xì)胞形態(tài)變化(100×)Fig.1 Morphological changes of SKOV3/DDP cells after being treated with different concentrations of Zedoary Oil for 48 hours(100×)

圖2 莪術(shù)油、順鉑、莪術(shù)油聯(lián)合順鉑作用于SKOV3/DDP 24 h后STAT3，Survivin，Caspase-3免疫組化結(jié)果(400×)Fig.2 Expression of STAT3，Survivin，VEGFC，Caspase-3 protein in SKOV3/DDP cells treated with Zedoary Oil，cisplatin，Zedoary Oil togeter with cisplatin detected by immunohistochemistry

表4 SKOV3/DDP胞漿或胞核中STAT3，Survivin，Caspase-3蛋白表達(dá)()Tab.4 Expression of STAT3，Survivin protein in the cytoplasm and cell nuclear of SKOV3/DDP cells()

表4 SKOV3/DDP胞漿或胞核中STAT3，Survivin，Caspase-3蛋白表達(dá)()Tab.4 Expression of STAT3，Survivin protein in the cytoplasm and cell nuclear of SKOV3/DDP cells()

注:不同組別兩兩比較，＊＊P＜0.01

組 別平均光密度值空白對(duì)照組 15μg/mL順鉑 37μg/mL莪術(shù)油 順鉑+莪術(shù)油STAT3 1.057±0.130 0.781±0.078＊＊ 0.639±0.061＊＊ 0.117±0.019＊＊Survivin 1.008±0.125 0.771±0.119＊＊ 0.580±0.064＊＊ 0.139±0.044＊＊Caspase-3 0.338±0.050 0.593±0.069＊＊ 0.732±0.067＊＊ 0.905±0.097＊＊

2.3 RT-PCR檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)變化情況 SKOV3/DDP細(xì)胞STAT3、Survivin表達(dá)量的變化:15μg/mL順鉑組STAT3 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較吸光度比值有所下降，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);37μg/mL莪術(shù)油組 STAT3、Survivin表達(dá)量與對(duì)照組比較表達(dá)下降，差異有顯著性(P＜0.05)。莪術(shù)油 +順鉑組 SKOV3/DDP細(xì)胞的STAT3、Survivin與對(duì)照組比較明顯下降，差異有顯著性(P＜0.05)。聯(lián)合用藥與順鉑組、莪術(shù)油組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。15μg/mL順鉑組與37μg/mL莪術(shù)油組比較有差異，莪術(shù)油組抑制作用明顯，見(jiàn)圖3。

SKOV3/DDP細(xì)胞Caspase-3 mRNA表達(dá)量的變化:15μg/mL順鉑組STAT3 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較吸光度比值增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);37μg/mL莪術(shù)油組Caspase-3 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較表達(dá)上調(diào)，差異有顯著性(P＜0.05)。莪術(shù)油 +順鉑組 SKOV3/DDP細(xì)胞的Caspase-3 mRNA與對(duì)照組比較明顯增強(qiáng)，差異有顯著性(P＜0.05)。聯(lián)合用藥與順鉑組、莪術(shù)油組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。15μg/mL順鉑組與37μg/mL莪術(shù)油組比較有差異，莪術(shù)油組抑制作用明顯，見(jiàn)圖3。

Spearman相關(guān)系數(shù)分析SKOV3/DPP細(xì)胞中STAT3與Survivin蛋白的相關(guān)系數(shù)為0.836，P=0.000＜0.01，呈正相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;STAT3與 Caspase-3蛋白的相關(guān)系數(shù)為 －0.857，P=0.000＜0.01，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)莪術(shù)油，順鉑及其二者聯(lián)合作用SKOV3/DDP細(xì)胞STAT3 Survivin，Caspase-3 mRNA的表達(dá)Tab.5 Expression of STAT3，Survivin Caspase-3 mRNA in the SKOV3/DDP cells treated with Zedoary Oil，cisplatin，Zedoary Oil togeter with cisplatin detected by RT-PCR()

表5 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)莪術(shù)油，順鉑及其二者聯(lián)合作用SKOV3/DDP細(xì)胞STAT3 Survivin，Caspase-3 mRNA的表達(dá)Tab.5 Expression of STAT3，Survivin Caspase-3 mRNA in the SKOV3/DDP cells treated with Zedoary Oil，cisplatin，Zedoary Oil togeter with cisplatin detected by RT-PCR()

注:不同組別間兩兩比較，＊＊P＜0.01

組 別平均光密度值空白對(duì)照組 15μg/mL順鉑 37μg/mL莪術(shù)油 順鉑+莪術(shù)油STAT3 0.913±0.089 0.835±0.021＊＊ 0.723±0.050＊＊ 0.597±0.025＊＊Survivin 0.850±0.064 0.841±0.032＊＊ 0.723±0.050＊＊ 0.572±0.049＊＊Caspase 0.505±0.015 0.586±0.034＊＊ 0.633±0.047＊＊ 0.808±0.044＊＊

圖3 RT-PCR檢測(cè)莪術(shù)油、順鉑、莪術(shù)油聯(lián)合順鉑作用于 SKOV3/DDP 24 h 后 STAT3，Survivin，Caspase-3表達(dá)情況Fig.3 Expression ofSTAT3， Survivin， VEGFC，Caspase-3 mRNA in SKOV3/DDP cells treated with Zedoary Oil，cisplatin，Zedoary Oil togeter with cisplatin detected by RT-PCR

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，死亡率高，五年生存率僅20%～30%。由于卵巢位于盆腔深部，早期病變不易發(fā)現(xiàn)，一旦出現(xiàn)癥狀多為晚期。目前，卵巢癌的治療方法主要是腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及術(shù)后正規(guī)足量聯(lián)合化療，可明顯提高患者帶瘤生存率。受經(jīng)濟(jì)條件的限制，以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療仍是部分患者首選的化療藥物，但在化療過(guò)程中患者表現(xiàn)出不同程度的獲得性耐藥及嚴(yán)重的毒副作用，是導(dǎo)致卵巢癌化療耐藥、未控的重要因素。延長(zhǎng)生存時(shí)間，提高患者的生存質(zhì)量，尋找低毒、高效的抗腫瘤藥物一直以來(lái)是廣大學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

天然中藥低毒、高效，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。研究證實(shí)莪術(shù)油不僅能直接抑制、破壞腫瘤細(xì)胞，還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、增強(qiáng)機(jī)體自身的免疫功能［17］，能較好地直接干預(yù)或輔助治療惡性腫瘤［2］。實(shí)驗(yàn)通過(guò)顯微鏡，MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)莪術(shù)油對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞增殖具有抑制作用。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)莪術(shù)油聯(lián)合順鉑所用于SKOV3/DDP細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率明顯增高，但其逆轉(zhuǎn)耐藥的相關(guān)機(jī)制尚無(wú)研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以SKOV3/DDP細(xì)胞作為研究對(duì)象，利用MTT法觀察不同質(zhì)量濃度莪術(shù)油對(duì)細(xì)胞增殖的影響。為進(jìn)一步了解其對(duì)STAT3信號(hào)通路的影響，初步探討可能作用機(jī)制，采用免疫組織化學(xué)法，RT-PCR法檢測(cè)莪術(shù)油對(duì)STAT3信號(hào)通路及下游靶基因相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)采用順鉑、莪術(shù)油聯(lián)合順鉑作用于SKOV3/DDP細(xì)胞后觀察莪術(shù)油對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路及下游靶基因相關(guān)蛋白影響。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP細(xì)胞中STAT3，Survivin表達(dá)增高，Caspase-3表達(dá)下調(diào)。莪術(shù)油聯(lián)合順鉑作用SKOV3/DDP細(xì)胞后細(xì)胞增殖抑制作用較莪術(shù)油單獨(dú)使用更加明顯。RT-PCR結(jié)果顯示順鉑，莪術(shù)油及其聯(lián)合作用于細(xì)胞SKOV3/DDP后各組間STAT3、Survivin蛋白的表達(dá)具有明顯差異，且P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示STAT3的表達(dá)與Survivin呈正相關(guān)關(guān)系，與Caspase呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，P＜0.01差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。莪術(shù)油與順鉑聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同或疊加增敏作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示莪術(shù)油對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的增值抑制作用可能影響STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路及其下游靶基因蛋白的表達(dá)。

正常情況下STAT3蛋白的激活快速而短暫，腫瘤組織中STAT3持續(xù)激活從而導(dǎo)致其下游靶基因的異常激活，下游靶基因如Survivin、caspases、cmyc等均已證實(shí)與細(xì)胞增殖、分化、惡性轉(zhuǎn)化、凋亡抑制等病理生理過(guò)程密切相關(guān)［18］。Gu等［7］研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中STAT3高表達(dá)與順鉑耐藥相關(guān)，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)阻斷STAT3信號(hào)通路可恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。Survivin作為凋亡抑制基因，幾乎在所有的惡性腫瘤中均有表達(dá)，其過(guò)量表達(dá)與腫瘤耐藥有關(guān)［19］，化療藥物可通過(guò)誘導(dǎo)Survivin的表達(dá)上凋，上調(diào)的Survivin可與Caspases特異性結(jié)合，抑制Caspase-3和Caspase-7的活性從而阻斷多種凋亡信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤耐藥的形成［20］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道一致。

實(shí)驗(yàn)研究顯示，莪術(shù)油對(duì)人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用;莪術(shù)油作用于SKOV3/DDP細(xì)胞后，STAT3及其下游靶基因表達(dá)Survivin、Caspase-3表達(dá)降低從而逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞的耐藥性。莪術(shù)油可增強(qiáng)SKOV3/DDP對(duì)順鉑敏感性，其相關(guān)機(jī)制可能與STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)，但仍需進(jìn)一步深入臨床研究。

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