HBD-1、HBD-2和NF-κBp65在紅皮病銀屑病皮損中的表達

王淑艷，翟寧，周鴻波，耿龍

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽110001）

紅皮病又稱剝脫性皮炎，是一種較嚴重的皮膚疾病，表現(xiàn)為皮膚彌漫性潮紅、腫脹、浸潤、脫屑，有時可以導(dǎo)致內(nèi)臟損傷和代謝紊亂，為多種原因引起的一種綜合病癥，死亡率也較高[1]。引起該病因素很多，包括銀屑病、濕疹-皮炎、藥物過敏反應(yīng)、惡性腫瘤及原因不明者，銀屑病是最常見的原因。人類防御素 β（human β-defensins,HBD）存在于皮膚和黏膜上皮組織,可分為兩種，HBD-1為組成性表達，HBD-2為誘導(dǎo)性表達且受到較多關(guān)注，感染和一些炎癥細胞因子如白細胞介素（IL）-1α、IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α、干擾素（IFN）-γ等能明顯誘導(dǎo)或增強HBD-2表達水平[2]。核轉(zhuǎn)錄因子κBp（Nuclear-factor-κBp，NF-κBp） 是一種作用廣泛的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控眾多細胞因子和炎癥介質(zhì)的基因表達，參與細胞內(nèi)信號傳遞，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，從而影響組織細胞的生理、病理反應(yīng)。本研究擬通過探討HBD-1、HBD-2和NF-κBp65在銀屑病紅皮病皮損中的表達情況，分析 HBD-1、HBD-2、NF-κBp65 在銀屑病紅皮病的發(fā)生和發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 對象來源 病例組：2012年1月—2013年3月30例紅皮病繼發(fā)于銀屑病者。女13例，男17例。年齡17～80歲，平均（56.00±16.59）歲。均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，經(jīng)臨床及組織病理證實的銀屑病紅皮病患者。正常對照皮膚10例，女6例，男 4 例，年齡 20～76 歲，平均（50.66±18.46）歲，來源于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科非皮膚疾病患者。

1.2 試劑和研究方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人HBD-1，2多克隆抗體以及NF-κBp65多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），羊抗兔二抗（河北博海生物工程有限公司），檸檬酸緩沖液，DAB顯色劑等。

1.2.2 免疫組織化學(xué)方法檢測 染色步驟嚴格按照試劑說明書進行。切片標本經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水后加50 μL山羊血清，室溫孵育20 min。去血清，分別滴加 50 μL的 1∶200稀釋兔抗人RBD-1、RBD-2和 NF-κBp65多克隆抗體，4℃過夜。滴加50 μL生物素標記的羊抗兔二抗，室溫孵育20 min，滴加50 μL辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，室溫孵育20 min。滴加100 μL新鮮配制的DAB，顯微鏡下觀察1～2 min至合適顯色。自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗返藍。梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.3 免疫組化結(jié)果判斷標準 以細胞漿中出現(xiàn)黃色至棕黃色顆粒，著色高于背景底色為陽性，胞漿不著色或呈淺黃色判斷為陰性。以染色強度和密度作半定量記錄（0～Ⅲ級），0級：陰性或染色弱，整個切片反應(yīng)率＜10%；Ⅰ級：輕度陽性（+），染色弱或部分染色，整個切片反應(yīng)率10%～20%；Ⅱ級：中度陽性（++），染色清晰，整個切片反應(yīng)率20%～50%；Ⅲ級：強染色（+++），染色清晰，整個切片反應(yīng)率＞50%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 組間比較進行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBD-1蛋白陽性表達 表現(xiàn)為細胞漿著色，也有細胞核內(nèi)著色，主要表達于基底層細胞。HBD-1在正常皮膚組織和紅皮病皮損組織中表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。證明HBD-1為固有表達，與疾病的發(fā)生、發(fā)展程度無關(guān)。

表1 正常皮膚和紅皮病皮損組織HBD-1的表達 例

2.2 HBD-2蛋白陽性表達 主要位于基底層細胞膜和細胞漿內(nèi)，紅皮病皮損中HBD-2表達的陽性率為96.67%,正常皮膚表達陽性率20%，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=42.65，P<0.01）。見圖 1、2，表 2。

圖1 正常皮膚組織HBD-2表達（H E染色×200）

圖2 紅皮病皮損組織HBD-2表達（H E染色×200）

表2 正常皮膚和紅皮病皮損組織HBD-2的表達 例

2.3 NF-κBp65表達 正常皮膚組織中，NF-κBp65為陰性表達或部分在細胞漿中表達，表達率20%。在紅皮病皮損中，NF-κBp65主要表達于基底層附近區(qū)域的細胞漿中，表達的陽性率為93.33%，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=39.44，P<0.01）。見圖 3、4，表 3。

表3 正常皮膚和紅皮病皮損組織NF-κB p65的表達 例

圖3 正常皮膚組織NF-κB p65表達（H E染色×200）

圖4 紅皮病皮損組織NF-κB p65表達（H E染色×200）

3 討論

β-防御素不僅具有直接殺傷病原體的作用，還具有化學(xué)趨化作用及與其他蛋白酶（如溶菌酶）的協(xié)同作用，抗菌活性和對白細胞趨化活性的發(fā)揮與組織中所含β-防御素濃度有關(guān)[3]。在感染局部，β-防御素被大量誘導(dǎo)表達和釋放，經(jīng)過擴散而濃度降低后，則喪失殺菌活性，發(fā)揮趨化活性，募集白細胞到達組織局部以清除入侵病原體[4]。

本研究表明HBD-1在正常組和紅皮病組織中均有表達，2 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），證實HBD-1為組成性表達，不受炎癥狀態(tài)的誘導(dǎo)，與多數(shù)學(xué)者研究結(jié)果一致。提示HBD-1主要是維持正常皮膚微生態(tài)的穩(wěn)定，在正常皮膚組織的先天性免疫中起著重要的作用。HBD-2最早是在銀屑病患者病灶中發(fā)現(xiàn)并分離成功的，因病灶中防御素表達高，故銀屑病病灶極少發(fā)生感染[5]。HBD-2不僅可直接殺菌而抵御入侵的病原微生物，還在介導(dǎo)獲得性免疫、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和創(chuàng)傷修復(fù)中起重要作用[6]。研究表明紅皮病皮損表皮HBD-2表達部位不僅為基底層，表皮全層均可見棕黃色染色，表達水平顯著增強，除與抗微生物活性相關(guān)以外，還可能與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。提示HBD-2可能介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)，參與了紅皮病的發(fā)病過程。通常上皮細胞不表達或微量表達HBD-2，但當感染時則大量表達[7]。

有研究表明銀屑病皮損處有大量活化的NF-κBp65。Lizzul等[8]研究表明正常皮膚中不存在活化形式的NF-κBp65，銀屑病患者非皮損區(qū)有少量NF-κBp65，皮損區(qū)則存在大量活化形式的NF-κBp65。本研究顯示銀屑病紅皮病皮損區(qū)NF-κBp65在表皮上層顯著表達，胞核見較深棕褐色顆粒表達，提示NF-κBp65異常表達可能與紅皮病的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)。Tsutsumi等[9]用LPS刺激鼠巨噬細胞證實了被激活的NF-κBp65參與了HBD-2的表達。

本研究通過檢測HBD-1、HBD-2和NF-κBp65在紅皮病皮損及正常皮膚組織中表達情況，探討三者在紅皮病中表達的關(guān)系。推測炎癥反應(yīng)及炎癥細胞因子可激活NF-κBp65信號通路實現(xiàn)對靶細胞的影響，并通過誘導(dǎo)HBD-2發(fā)揮作用，參與銀屑病紅皮病的發(fā)病。

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