不同低氧訓練模式對肌衛(wèi)星細胞NO/HGF/c-Met激活通路的影響

黃 丹，孟 艷，翁錫全，林文弢

(1.佛山科學技術(shù)學院，廣東 佛山528000;2.廣州體育學院，廣東廣州510500)

以往的研究結(jié)果顯示［1，2］，高原訓練提高有氧耐力的同時也出現(xiàn)骨骼肌蛋白丟失、肌纖維橫徑縮小、肌肉萎縮以及肌細胞凋亡加劇等現(xiàn)象而影響大強度運動能力的發(fā)揮。正是出于高原訓練對大強度運動能力不利影響的考慮以及人工低氧技術(shù)成熟應用，運動訓練專家對傳統(tǒng)高原訓練方法進行了改進，陸續(xù)提出了間歇性低氧訓練(IHT)、高住低練(Hi-Lo)、低住高練(LoHi)和高住高訓低練(HiHiLo)等低氧訓練模式［3，4］，但對于不同低氧訓練模式對骨骼肌蛋白影響及其機制仍在探討中，已有研究者從激素水平、生長因子等不同層面的變化探討不同低氧訓練對骨骼肌蛋白質(zhì)合成作用的影響［5－7］，而骨骼肌蛋白質(zhì)合成與衛(wèi)星細胞的激活、增殖有關(guān)，NO/HGF/c-Met是肌衛(wèi)星細胞激活主要信號通路之一［8］，目前從這一角度分析不同低氧訓練模式對肌蛋白質(zhì)影響還鮮見報道。因此，本文以SD大鼠為研究對象觀察4周不同低氧訓練模式對骨骼肌蛋白含量及肌衛(wèi)星細胞NO/HGF/c-Met激活信號通路的影響，探討低氧訓練對骨骼肌質(zhì)量的影響機制，為科學選擇低氧訓練模式提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與低氧訓練方案

本實驗動物來源、分組和低氧訓練方案與黃森等報道為同一模型［9］，具體分組為低住安靜組(LC)、低住低練組(LL)、高住安靜組(HC)、高住低練組(HL)和高住高訓低練組(HHL)，每組10只，以上實驗干預為4周。

1.2 樣品采集與處理

各組大鼠在最后一次干預后24小時麻醉解剖，取股四頭肌，用干凈濾紙將其吸干，并用錫紙包裹后立即用液氮速凍后，轉(zhuǎn)入－80℃冰箱中保存。測試前用精密天平稱取其200mg放入5mL燒杯內(nèi)，按照1:9的比例加入預冷生理鹽水置勻漿機上冰浴勻漿，直至肉眼無可視懸浮物。將勻漿液倒入試管，靜置10min，在4℃以下以2 000 r/min離心10 min，取上清液測試相關(guān)指標。

1.3 指標測試及方法

采用考馬斯亮藍方法測試股四頭肌中蛋白質(zhì)含量，一氧化氮(NO)采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，以S22PC分光光度計測試;利用RT－2100型多功能酶標儀測試股四頭肌肝細胞生長因子(HGF)、肝細胞因子受體蛋白(c-Met)、促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)的含量，試劑盒均由美國ADL公司提供，所有測試指標的操作步驟嚴格按試劑盒要求進行。

1.4 數(shù)理統(tǒng)計法

運用肖維勒準則對原始數(shù)據(jù)進行異常數(shù)值篩選。各數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標準差來表示，并利用SPSS13.0軟件進行One-way ANOVA分析，差異顯著性標準為P＜0.05，極顯著性水平為P＜0.01。

2 研究結(jié)果

2.1 不同低氧訓練模式大鼠股四頭肌蛋白含量的變化

表1可知，四周低氧訓練干預后，HHL組股四頭肌蛋白含量最低，且顯著性低于其他4組(P＜0.05)，而其他4組間沒有顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 不同低氧訓練模式大鼠股四頭肌NO/HGF/c-Met信號表達的變化

四周低氧訓練干預后，從骨骼肌衛(wèi)星細胞關(guān)鍵激活信號因子NO的變化發(fā)現(xiàn)，HHL組含量最高，并顯著性高于LC、LL組(P＜0.05);而各組大鼠股四頭肌中HGF、c-Met含量差異不顯著(P＞0.05)，但HHL組股四頭肌中的HGF含量相對較低;另外，HHL組骨骼肌MAPK水平最低，并顯著性或極顯著性低于LC組、LL組及HC組(P＜0.05，P＜0.01)，HL組也顯著性低于LL組(P＜0.05)。

表1 各組大鼠股四頭肌蛋白、NO、HGH、c-Met及MAPK比較

3 分析與討論

3.1 不同低氧訓練模式對骨骼肌蛋白含量的影響

蛋白質(zhì)是骨骼肌重要組成成分，其代謝變化直接影響骨骼肌收縮及力量、速度素質(zhì)。近些年國內(nèi)外研究報道［10－12］，大多數(shù)研究者認為低氧運動可導致骨骼肌蛋白質(zhì)丟失抑制蛋白質(zhì)的合成代謝，并提出其主要原因運動訓練及低氧干預加強了機體的缺氧應激，易造成肌肉血流量減少，蛋白質(zhì)的翻譯環(huán)節(jié)出現(xiàn)抑制，而導致其合成代謝降低，引起肌纖維變細甚至萎縮，從而導致肌肉力量丟失。

本實驗結(jié)果顯示，LL組大鼠肌蛋白含量上升，說明一定強度的耐力運動可促進蛋白質(zhì)的合成代謝增加，而在此強度基礎(chǔ)上實施低氧暴露，肌蛋白含量出現(xiàn)下降趨勢。保留相同低氧刺激方式，改變運動模式時發(fā)現(xiàn)采用HHL進行訓練時，大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)顯著下降，由此現(xiàn)象進一步證實運動后低氧暴露更加劇了骨骼肌的缺血、缺氧狀態(tài)，從而抑制骨骼肌蛋白質(zhì)的合成代謝。

3.2 不同低氧訓練對肌衛(wèi)星細胞NO/HGF/c-Met激活通路的影響

骨骼肌的增生肥大依賴于肌肉蛋白質(zhì)合成大于分解的凈增加，然而肌蛋白質(zhì)合成增加，肌纖維增粗與骨骼肌衛(wèi)星細胞的激活、分化、融合和成熟等過程密切相關(guān)，然而肌衛(wèi)星細胞的激活過程受多種信號分子調(diào)控。目前研究認為NO、HGF介導的信號級聯(lián)對衛(wèi)星細胞激活起到主要調(diào)控作用［13］。本實驗也針對骨骼肌衛(wèi)星細胞NO/HGF/c-Met激活通路探討不同低氧訓練模式對其的影響，以分析其影響骨骼肌蛋白質(zhì)合成代謝的機制。

NO被認為是激活衛(wèi)星細胞的信號分子。有研究表明運動訓練、負重、損傷、剪切應力或機械達拉的刺激下，使NOS活性或含量提高，促進NO的釋放，進而激活鳥苷酸環(huán)化酶，催化產(chǎn)生環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)，而激活MAPK信號分子［14］;或NO可引發(fā)肌纖維快速釋放HGF，通過HGF信號級聯(lián)進而激活衛(wèi)星細胞［15］。目前，有研究表明［16］短期低氧暴露可使血清中NO上升，并認為由于機體代償能力增強所致，以適應突發(fā)的高原或低氧環(huán)境的應激;也有研究者［17］針對不同低氧訓練對大鼠骨骼肌NOS系統(tǒng)影響的探討，發(fā)現(xiàn)6周的高住高練骨骼肌nNOS mRNA表達升高234%，從而增加骨骼肌NO的含量，有助于毛細血管的舒張。本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境中NO含量均出現(xiàn)上升，其中HHL組顯著升高。多數(shù)研究證實［13，14］NO通過HGF激活靜息狀態(tài)下的衛(wèi)星細胞的信號作用，但Leiter等［18］采用不同年齡的小鼠，通過機械牽拉或NO刺激發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加，小鼠趾長伸肌中的衛(wèi)星細胞激活數(shù)量對NO濃度越來越不敏感。而本實驗的低氧訓練模式下，骨骼肌NO升高，然而相應HGF、MAPK的含量出現(xiàn)下降。顯然實驗結(jié)果說明骨骼肌內(nèi)NO的增加并未激活HGF、MAPK的活性，HGF、MAPK的下降與骨骼肌蛋白含量的變化是一致的。其原因可能是該低氧訓練模式中，骨骼肌產(chǎn)生的NO與鳥苷酸環(huán)化酶活性部位的結(jié)合力下降，無法使cGMP水平上升而激活cGMP依賴的蛋白激酶系統(tǒng)而發(fā)揮生物學作用，但仍需進一步實驗驗證。

HGF是激活衛(wèi)星細胞的重要細胞因子，具有促細胞有絲分裂的特性，是組織再生過程最重要的調(diào)控因子之一。其作用表現(xiàn)在兩個方面:1)與衛(wèi)星細胞的c-Met受體結(jié)合，通過MAPK和三磷酸肌醇激酶(IP3K)等有關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和促細胞分裂的多個信號途徑，激活衛(wèi)星細胞［14，19］;2)HGF下調(diào)肌肉生長抑制素(myostatin)的表達，正向調(diào)控衛(wèi)星細胞激活;然而HGF濃度過高會上調(diào)myostatin mRNA水平，增加myostatin蛋白的分泌和表達水平，從而使激活的衛(wèi)星細胞恢復其安靜狀態(tài)［20－22］，因此 ，HGF濃度可對衛(wèi)星細胞狀態(tài)進行來負反饋調(diào)節(jié)。Wozniak和Anderson［23］的實驗證明了這一結(jié)果，他們利用機械牽拉肌原細胞，能誘導內(nèi)源性HGF的釋放并上調(diào)衛(wèi)星細胞表面c-Met的表達，并同時在培養(yǎng)基中添加高濃度HGF時，激活的衛(wèi)星細胞數(shù)量卻減少。從本實驗結(jié)果可看出，相對于其他低氧訓練模式，HHL這種低氧訓練模式使大鼠骨骼肌HGF含量降低，而且其股四頭肌蛋白含量呈現(xiàn)顯著下降，然而導致HGF下降的原因可能與低氧訓練強度有關(guān)，有待深入研究。

c-Met作為HGF受體，在骨骼肌細胞中以跨膜蛋白的形式結(jié)合在衛(wèi)星細胞表面，起來信號轉(zhuǎn)導作用，同時c-Met也是衛(wèi)星細胞 一種特異性標記物。有研究［24］針對耐力和力量訓練C57BL/6小鼠，發(fā)現(xiàn)其脛前肌c-Met mRNA表達水平顯著增多，而混合訓練組脛前肌c-Met mRNA表達增加不顯著。本實驗結(jié)果各組大鼠股四頭肌c-Met含量變化不明顯，說明骨骼肌衛(wèi)星細胞并未出現(xiàn)明顯激活。

MAPK是將細胞外信號傳導到細胞核內(nèi)引起生化反應的重要信號調(diào)控系統(tǒng)，它的激活介導了多條信號轉(zhuǎn)導通路，并參與細胞生長、分化和凋亡等多種功能的調(diào)節(jié)。如NishimuraM等［25］研究發(fā)現(xiàn)腦缺血預適應可通過誘導p38 MAPK的激活來提高海馬組織對缺血的耐受能力;運動和肌肉收縮增強MAPK信號分子活性，提高下游轉(zhuǎn)錄因子活性，直接影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化［23－25］。如 Widegren 等［26］研究時發(fā)現(xiàn)以70%VO2max強度進行單腿功率自行車實驗可以激活運動腿骨骼肌ERK1/2和p38信號通路，但非運動腿骨骼肌ERK1/2和p38沒有活化。MAPK信號通路激活對運動形式、時間和強度有一定的依賴性。本實驗中可看出低氧結(jié)合運動使得股四頭肌內(nèi)MAPK下降，而常氧運動組的MAPK存在上升趨勢。綜上，該低住并結(jié)合不同方式訓練，均未能有效地激活骨骼肌衛(wèi)星細胞，而使得肌蛋白丟失。

4 結(jié)論

1)四周高住高訓低練可導致骨骼肌蛋白的丟失。

2)高住高訓低練引起肌蛋白的減少與肌衛(wèi)星細胞NOHGF-c-Met激活通路中HGF分泌減少及MAPK活性下降有關(guān)。

3)至于高住高訓低練組肌組織NO的升高但未刺激HGF活性及MAPK磷酸化增加，該結(jié)果是否與低氧訓練模式中的訓練內(nèi)容有關(guān)尚待進一步研究和探討。

［1］ Friedmann B，Kinscherf R，Borisch S，et al.Effects of low-resistance/high-repetition strength training in hypoxia on muscle structure and gene expression［J］.Pflugers Arch.2003，446(6):742－751.

［2］ 賀道遠，曾凡星，葉 鳴.高住低練對大鼠體重和骨骼肌形態(tài)學影響［J］.成都體育學院學報，2008，34(2):72－75.

［3］ 趙 鵬，馮連世.新的低氧訓練模式研究及應用進展［J］.體育科學，2005，25(6):70－74.

［4］ 胡 揚.模擬高原訓練的新發(fā)展——從HiLo到 HiHiLo［J］.中國運動醫(yī)學雜志，2005，24(1):69－72.

［5］ 葉 鳴，賀道遠，劉 霞，等.低氧和運動經(jīng)AR-IGF-1對骨骼肌蛋白質(zhì)合成的作用［J］.天津體育學院學報，2010，25(2):125－129.

［6］ Connolly E，Braunstein S，F(xiàn)ormenti S，et al.Hypoxia inhibits protein synthesis through a 4E-BP1 and elongation factor 2 kinase pathway controlled by mTOR and uncoupled in breast cancer cells［J］.Mol Cell Biol，2006，26(10):3955－3965.

［7］ Tinton S，Calderon PB.Role of protein phosphorylation in the inhibition of protein synthesis caused by hypoxia in rat hepatocytes［J］.Int J Toxicol，2001，20(1):21－27.

［8］ 潘玲梅，王 恬，石放雄.肌衛(wèi)星細胞激活和補給的分子調(diào)控與肌肉疾?。跩］生物化學與生物物理進展，2006，33(9):811－815.

［9］ 黃 森，劉建紅，周志宏，等.高住低練對大鼠骨骼肌 PI3K/PKB/mTOR信號通路基因表達的影響［J］.中國運動醫(yī)學雜志，2013，32(2):137－141.

［10］ Wouters BG，van den Beucken T，Magagnin MG，et al.Control of the hypoxic response through regulation of mRNA translation［J］.Semin Cell Dev Biol，2005，16(4－5):487－501.

［11］ 葉 鳴，賀道遠，劉 霞，等.低氧運動應激和適應對骨骼肌蛋白質(zhì)合成的作用［J］.北京體育大學學報，2010，33(4):39－43.

［12］ Koumenis C，Naczki C，Koritzinsky M，et al.Regulation of protein synthesis by hypoxia via activation of the endoplasmic reticulum kinase PERK and phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha［J］.Mol Cell Biol，2002，22(21):7405－16.

［13］ Anderson J，Pilipowicz O.Activation of muscle satellite cells in single-fiber cultures［J］.Nitric Oxide，2002，7(1):36－ 41.

［14］ Anderson J E.A role for nitric oxide in muscle repair:nitricoxidemediated activation of muscle satellite cells［J］.Mol Biol Cell，2000，11(5):1859－1874.

［15］ Tatsumi R，Liu X，Pulido A，et al.Satellite cell activation in stretched skeletal muscle and the role of nitric oxide and hepatocyte growth factor［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2006，290(6):C1487－C1494.

［16］ 潘同斌，毛杉杉，袁建琴，等.低氧暴露和力竭運動對大鼠血清NO含量及NOS活力的影響［J］.中國運動醫(yī)學雜志，2005，24(4):474－475.

［17］ 趙 鵬，路瑛麗，馮連世，等.低氧訓練對大鼠骨骼肌一氧化氮合酶(NOS)系統(tǒng)的影響［J］.體育科學，2009，29(4):44－50.

［18］ Leiter J R S，Anderson J E.Satellite cells are increasingly refractory to activation by nitric oxide and stretch in aged mouse-muscle cultures［J］.The international journal of biochemistry ＆ cell biology，2010，42(1):132－136.

［19］ Furge K A，Zhang Y W，Vande Woude G F.Met receptor tyrosine kinase:enhanced signaling through adapter proteins［J］.Oncogene，2000，19(49):5582－5589.

［20］ Birchmeier C，Gherardi E.Developmental roles of HGF/SF and its receptor，the c-Met tyrosine kinase［J］.Trends in cell biology，1998，8(10):404－410.

［21］ Yamada M，Tatsumi R，Yamanouchi K，et al.High concentrations of HGF inhibit skeletal muscle satellite cell proliferation in vitro by inducing expression of myostatin:a possible mechanism for reestablishing satellite cell quiescence in vivo［J］.American Journal of Physiology-Cell Physiology，2010，298(3):C465－ C476.

［22］ McCroskery S，Thomas M，Maxwell L，et al.Myostatin negatively regulates satellite cell activation and self-renewal［J］.J Cell Biol，2003，162(6):1135－1147.

［23］ Wozniak A C，Anderson J E.Nitric oxide-dependence of satellite stem cell activation and quiescence on normal skeletal muscle fibers［J］.Developmental Dynamics，2007，236(1):240－250.

［21］ 陳 濤，陳彩珍，盧 健.耐力、力量和混合運動對成年C57BL/6小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞激活信號通路的影響［J］.體育科學，2011，31(9):69－76.

［22］ Nishimura M，Sugino T，Nozaki K，et al Activation of p38 kinase in the gerbil hippocampus showing ischemic tolerance［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2003，23:1052－1059.

［23］ Russ DW，Lovering RM.Influence of activation frequency on cellular signaling pathways during fatiguing contractions in rat skeletal muscle［J］.Experimental Physiology，2006，91:957－966.

［24］ Creer A，Gallagher P，Slivka D，et al.Influence of muscle glycogen availability on ERK1/2 and Akt signaling after resistance exercise in human skeletal muscle［J］.J Appl Physiol，2005，99:950－956.

［25］ Carlson C，F(xiàn)an ZJ，Gordon S，et al.Time course of the MAPK and PI3-kinase response within 24 h of skeletal muscle overload［J］.J Appl Physiol，2001，91:2079－2087.

［26］ Widegren U，Jiang X J，Krook A，et al.Divergent effects of exercise on metabolic and mitogenic signaling pathways in human skeletal muscle［J］.The FASEB Journal，1998，12:1379－1389.