• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    TLM鈦合金表面白蛋白涂層的制備及抗凝血性研究

    2013-10-31 05:53:12劉春潮于振濤韓建業(yè)牛金龍
    鈦工業(yè)進展 2013年5期
    關鍵詞:抗凝血親水性白蛋白

    劉春潮,于振濤,余 森,韓建業(yè),牛金龍

    (西北有色金屬研究院,陜西 西安 710016)

    0 引言

    生物醫(yī)用鈦合金材料由于其良好的生物相容性、在血液環(huán)境中極為卓越的耐腐蝕性能和物理化學穩(wěn)定性、出色的綜合力學性能匹配,而成為最具發(fā)展前途的生物材料,已在心腦血管介入醫(yī)學領域得到了廣泛的關注,并已開始部分替代目前臨床常用的316L不銹鋼。但是,血液接觸類金屬醫(yī)療器械由于自身固有的物理特性和表面特征,植入人體后,在充滿電解質的血液中其表面會迅速產(chǎn)生蛋白質吸附、腐蝕以及對血管壁的損傷等界面過程,而這些都會引起支架表面局部凝血,進而觸發(fā)產(chǎn)生血栓[1-2]。

    已有大量研究結果發(fā)現(xiàn),生物材料植入體內后,幾秒鐘內即有大量蛋白質分子粘附在材料表面,形成蛋白質吸附層(厚度10~20 nm),然后再在蛋白質吸附層上進一步吸附凝血因子并最終誘發(fā)血液凝固[3-7]。即植入材料抗凝血性能的優(yōu)劣與其表面對血漿蛋白的吸附行為和程度密切相關,且主要與蛋白質種類緊密相關。人體血漿蛋白中主要包含三種蛋白質,其中纖維蛋白會誘導血小板的激活、變形,并且會被替代為一種不溶性的高分子量蛋白而導致內源性凝血。但有研究表明,當有白蛋白覆蓋在材料表面時能形成很薄的白蛋白層,該膜層能起到隔離血液成分和材料反應的作用,從而顯著減少纖維蛋白原和血小板等凝血組織在植入材料表面的粘附,提高材料的抗凝血性能,這一現(xiàn)象被稱之為“白蛋白鈍化”[6-8],可用于血液接觸材料或器械的表面抗凝血改性處理。

    Ti-3Zr-2Sn-3Mo-25Nb(TLM)合金是西北有色金屬研究院根據(jù)臨床數(shù)據(jù)反饋、需求及發(fā)展趨勢開發(fā)的一種新型近β型醫(yī)用鈦合金材料,它不含Al、Ni等細胞毒性元素,體內生物相容性優(yōu)于目前臨床常用的316LSS、Ti-6Al-4V等金屬材料,且具有良好的生物力學性能匹配和冷加工性能,是有望獲得廣泛臨床應用的新型介入醫(yī)用鈦合金材料[9-11]。為了進一步提高TLM合金的抗凝血性能,首先通過溶膠-凝膠法在其表面制備一層TiO2薄膜,并通過化學法對該薄膜進行活化處理,然后再通過靜電自組裝和共價交聯(lián)反應將白蛋白分子固定在薄膜表面,最后對白蛋白修飾前后的TLM合金表面的抗凝血性能進行測試、對比評價和分析。

    1 實驗

    1.1 實驗材料

    將TLM合金加工成φ10 mm×2 mm的圓片狀樣品,經(jīng)砂紙初步打磨平整后再在拋光機上拋光至鏡面,并依次在稀鹽酸、丙酮、去離子水和無水乙醇中超聲波清洗15 min,真空干燥備用。

    1.2 TiO2薄膜的制備及活化處理

    TiO2薄膜是通過溶膠-凝膠法制成的。前驅物為Ti(OC4H9)4,溶劑為乙二醇甲醚,配置好的溶膠靜置陳化 24 h 后備用[5-6,12-13]。

    通過提拉法鍍膜。鍍膜后將樣品放入箱式電阻爐中緩慢升溫至500℃保溫l h,采用爐冷方式冷卻至室溫。

    將鍍膜后的樣品依次在鹽酸、雙氧水混合溶液和丙稀酰胺、硝酸等的混合溶液中活化處理8 h。之后,將試樣依次在0.05 mol/L的NaOH溶液和去離子水中漂洗干凈,真空干燥。

    1.3 白蛋白的靜電自組裝固定

    牛血清白蛋白為生物純,由Sigma公司提供,并配制成1 mg/mL的白蛋白的檸檬酸溶液,調節(jié)pH至4.8。隨機挑取TLM鍍膜活化試樣9個,先將全部試樣浸入白蛋白溶液中,恒溫振蕩2 h后徹底清洗干凈,再將上述樣品全部浸沒入1 mg/L的硫酸葡聚糖特征溶液中,并繼續(xù)恒溫振蕩1 h,隨后在去離子水中超聲波清洗30 min。重復以上操作6次,然后在2.5%的戊二醛溶液中浸泡2 h,最后在磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)中超聲清洗30 min,真空晾干。

    1.4 涂層相組成測試

    通過X射線衍射儀檢測分析白蛋白涂層的相組成。測試條件:銅靶,管電壓30 kV,電流20 mA,掃描速度0.03°/s,掃描區(qū)間15°~80°,掠射角1°。通過掃描電鏡(JSM-6460)觀察涂層的表面微觀形貌。通過原子力顯微鏡(Veeco)表征白蛋白涂層表面的三維特征。

    1.5 薄膜親水性的測定

    用接觸角測試儀(Phoenix-300)檢測白蛋白處理前后TLM合金樣品對蒸餾水的接觸角,比較其表面親水性的變化。

    1.6 凝血時間的測定

    通過測量動態(tài)凝血時間來對比研究白蛋白改性前后TLM合金的抗凝血性能變化,具體操作如下:精確移取0.2 mL新鮮抗凝人血,分別滴加在白蛋白改性涂層及TLM合金空白樣品表面,再精確移取濃度為0.2 mol/L的CaCl2溶液0.2 μL于樣品表面,依次在10、20、30、40、50和60 min時用蒸餾水緩慢沖洗樣品表面,并將各次沖洗的洗液分別收集在96孔板中,用酶標儀(CliniBio128C,Austria)在550 nm波長處測定各洗液的吸光度值。重復測量5次,取平均值。

    1.7 血小板黏附實驗

    通過血小板黏附實驗評價白蛋白涂層對主要凝血組織——血小板的激活反應。具體操作如下:分別通過微量進樣器移取30 μL新鮮富血小板血漿滴加在白蛋白涂層和空白樣品表面,室溫接觸30 min后用PBS緩沖液緩慢清洗各樣品,隨后將樣品完全浸沒在2.5%的戊二醛溶液中30 min,最后經(jīng)超臨界干燥后,采用掃描電鏡(JSM-6700)觀察各樣品表面黏附的血小板的形態(tài)和數(shù)量。

    2 結果與討論

    2.1 涂層相組成

    TLM合金表面抗凝血涂層的XRD衍射曲線如圖1所示??梢钥闯?,涂層基體主要是TiO2薄膜,除少量雜質峰外,主要由金紅石和銳鈦礦組成,且衍射峰尖銳狹窄,沒有寬化和分裂,說明結晶度較高[12]。

    圖1 抗凝血涂層的XRD衍射譜圖Fig.1 XRD pattern of the anticoagulant coating

    雖然鈦合金在有氧的環(huán)境下,其表面也會迅速原位生成一層Ti-O膜,并且該氧化鈦膜也具有較好的抗凝血性能,但是這種自發(fā)生成的Ti-O膜通常為非晶態(tài),其血液相容性不如金紅石或銳鈦礦。

    2.2 薄膜的表面分析

    圖2為TLM合金表面經(jīng)白蛋白修飾前后的微觀形貌。從TLM合金表面溶膠-凝膠膜的SEM照片(圖2a)可以看出,TiO2薄膜表面平整,但含有少量微裂紋,經(jīng)表面活化和白蛋白覆膜處理后(圖2b),薄膜表面微小裂紋進一步減少,表面更為光滑,平均粗糙度為200 nm(圖2c)。

    溶膠-凝膠法是一種經(jīng)典的化學薄膜制備方法[12-13],但在薄膜干燥和熱處理過程中,由于凝膠是一種有機混合物,受熱時會迅速干燥揮發(fā),質量損失極大,導致收縮率也很大。本實驗中,由于基體材料是鈦合金,其熱膨脹率很小,因此薄膜在干燥和高溫熱處理時會產(chǎn)生裂紋。此外,由于凝膠的表層與空氣接觸后,會馬上凝膠化,干燥形成一層硬殼,而凝膠內部固化較慢,并且在熱處理時,凝膠有機物大部分會變成氣體,氣體受熱膨脹從而沖破表層硬殼,也會在薄膜表面產(chǎn)生裂紋。因此,溶膠-凝膠薄膜表面通常都會有少量的微小裂紋。但經(jīng)長時間在熱的官能化溶液中活化處理和靜電自組裝涂膜后,薄膜表面微裂紋會明顯減少,表面更加光滑。光滑的表面不利于血小板和纖維蛋白等凝血組織的黏附,因此抗凝血性能更好。

    圖2 TLM合金表面經(jīng)白蛋白修飾前后的微觀形貌Fig.2 Micrographs of the coatings before and after modification by albumin

    2.3 親水性測試

    TLM合金表面經(jīng)白蛋白修飾前后蒸餾水的接觸角如表1所示。

    表1 TLM合金表面經(jīng)白蛋白修飾前后對蒸餾水的接觸角Table 1 Contact angle of TLM alloy before and after surface modification by albumin

    從表1可以看出,試樣表面經(jīng)白蛋白修飾處理以后,接觸角從34.5°降低到19.1°,即親水性變好。TiO2薄膜本身具有很好的親水性[14-16],且TLM合金經(jīng)過溶膠-凝膠膜和白蛋白修飾處理后,材料表面形成了一個生物活性白蛋白層,并且在此過程中,涂層表面引入了OH-和NH2-親水基團,同時白蛋白分子也帶有大量親水基團,從而材料的親水性能得到了改善[17]。

    研究表明,生物材料植入人體組織并與血液接觸后,血漿中的各種蛋白質以及部分凝血因子、抗凝血因子會迅速吸附在植入材料表面[7],且吸附的蛋白質的類別、數(shù)量及立體空間構象等特性與植入材料的物理、化學等表面特征密切相關,并會對血小板等凝血組織與植入材料表面的交互作用、動態(tài)吸附與解吸附過程產(chǎn)生巨大的影響[7,17-18]。例如,吸附在材料表面的蛋白質發(fā)生變性、活化將誘導或啟動血液內源、外源凝血途徑,與此同時,血小板在材料表面的黏附、變形和激活等反應又會進一步引起其它血小板發(fā)生凝血反應,最終大量不溶性的纖維蛋白和血小板等物質共同形成血栓[7,17]。

    而材料表面的親/疏水性能是影響材料表面蛋白質吸附、細胞黏附的一個重要因素。對于抗凝血材料,材料表面的親水性越好,蛋白質吸附量越小,抗凝血性越好。這是由于親水性材料含有大量的水,與蛋白質和細胞中的水分子的有序排列極為相似,它們之間的相互作用力很小,與血液的界面能很小,因此,具有良好的抗凝血性。

    2.4 凝血時間的測定

    圖3為TLM合金表面經(jīng)白蛋白修飾處理前后的動態(tài)凝血時間測試結果。

    圖3 TLM合金表面經(jīng)白蛋白修飾前后的動態(tài)凝血時間測試結果Fig.3 Test result of dynamic coagulation time of TLM alloy before and after surface modifacation by albumin

    植入材料與血液接觸時會發(fā)生溶血反應,未凝血的紅細胞溶解在洗脫液中,溶解的自由紅細胞數(shù)量越多,洗脫液的吸光度值就越高,即凝結在植入材料表面的紅細胞數(shù)量就越少,說明材料的抗凝血作用越好。

    由圖3可以看出,與血液的接觸時間相同時,表面經(jīng)白蛋白修飾處理后的TLM合金的吸光度值較未處理的高。由此說明,白蛋白修飾后的TLM合金具有較好的抗凝血性,即通過上述白蛋白修飾處理使TLM合金的抗凝血性能得到了提高。

    圖4為TLM合金表面經(jīng)白蛋白修飾前后材料表面的血小板黏附照片。由圖4可以看出,表面經(jīng)白蛋白涂層改性后(圖4a),試樣表面黏附的血小板數(shù)量很少,且黏附的血小板形態(tài)沒有發(fā)生明顯的變形、團聚等激活跡象。而未經(jīng)處理的空白TLM合金表面(圖4b)不僅黏附著大量的血小板,而且血小板明顯被激活。

    圖4 TLM合金表面經(jīng)白蛋白修飾前后的血小板黏附照片F(xiàn)ig.4 SEM micrographs of platelets adhered of TLM alloy before and after modifacation by albumin

    蛋白質在植入材料表面的吸附是一個非常復雜的過程,目前對其微觀機理也沒有形成完全統(tǒng)一的解釋。一般認為:血漿蛋白在高分子生物材料表面上的吸附雖然與蛋白質的濃度有關,但更取決于蛋白質的種類和材料表面的組成與結構。

    纖維蛋白原(凝血因子I)是和凝血密切相關的血漿蛋白質,在材料表面的吸附不僅會啟動人體凝血途徑,還可轉化為不溶性的纖維蛋白,它是血栓的主要成分之一。而Wahid Khan等[18-19]的研究結果表明,人工植入材料表面可逆吸附的血漿白蛋白層則具有良好的抗凝血性能。但是,在醫(yī)用金屬材料表面,白蛋白的競爭吸附率卻顯著低于纖維蛋白原及其它凝血因子[20]。而且,蛋白質在人工植入生物材料表面吸附后,其空間構象會發(fā)生不同程度的變化,在疏水性材料上的變化較在親水性材料上的要大。而 Y.L.Jeyachandran等[19-20]的研究結果表明,只有吸附后構象變化小,具有可逆吸附特性的血漿白蛋白層才具有良好的抗凝血性能。

    因此,本實驗通過化學方法提高TLM合金表面的親水性,并將白蛋白共價固定在具有良好血液相容性的TiO2表面[14-15],不僅可增加材料表面的白蛋白濃度,還能盡量保持白蛋白的空間構象,極大程度協(xié)同利用TiO2和白蛋白的抗凝血效果,顯著提高TLM合金的抗凝血性能。

    3 結論

    (1)通過溶膠-凝膠法在TLM合金表面鍍TiO2膜,并將該薄膜活化處理后通過靜電自組裝可在其表面制備出白蛋白涂層。

    (2)經(jīng)白蛋白涂層修飾后,TLM合金表面的親水性增強,動態(tài)凝血時間也有所延長,合金表面黏附的血小板數(shù)量很少且沒有被明顯激活,即白蛋白涂層可明顯提高TLM合金的抗凝血性能。

    [1]Pradier C M,Costa D,Rubio C,et al.Role of salts on BSA adsorption on stainless steel in aqueous solutions.I.FTIRRAS and XPS characterization[J].Surface and Interface Analysis,2002,34(1):50-54.

    [2]Weng Y J,Qi F,Huang N,et al.Photochemical immobilization of bovine serum albumin on Ti-O and evaluations in vitro and in vivo[J].Applied Surface Science,2008,255(2):489-493.

    [3]Brynda E,Milan Houska,Markéta Jirou?ková,et al.Albumin and heparin multilayer coatings for blood-contacting medical devices[J].Journal of Biomedical Materials Research,2000,51(2):249-257.

    [4]Kowalczyńska H M,Nowak-Wyrzykowska M,Szczepankiewicz A A,et al.Albumin adsorption on unmodified and sulfonated polystyrene surfaces,in relation to cell-substratum adhesion[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2011,84(2):536-544.

    [5]Wojciech Chrzanowski,Ensanya Ali Abou Neel,David Andrew Armitage,et al.Effect of surface treatment on the bioactivity of nickel-titanium[J].Acta Biomaterialia,2008,4(6):1969-1984.

    [6]Claudia Sperling,Milan Houska,Eduard Brynda,et al.In vitro hemocompatibility of albumin-heparin multilayer coatings on polyethersulfone prepared by the layer-by-layer technique[J].Journal of Biomedical Materials Research Part A,2006,76A(4):681-689.

    [7]余森,于振濤,牛金龍,等.醫(yī)用鈦合金 Ti-3Zr-2Sn-3Mo-25Nb表面自組裝抗凝血復合涂層的構建及其血液相容性研究[J].金屬熱處理,2012(27):16-20.

    [8]Weng Y J,Hou R X,Li G C,et al.Immobilization of bovine serum albumin on TiO2film via chemisorption of H3PO4interface and effects on platelets adhesion[J].Applied Surface Science,2008,254(9):2712-2719.

    [9]Zhentao Yu,Gui Wang,Xiqun Ma,et al.Development of biomedical near β titanium alloys[J].Materials Science Forum,2009,618-619:303-306.

    [10]張明華,于振濤,周廉,等.β型鈦合金材料的生物相容性評價[J].稀有金屬材料與工程,2007,36(10):1815-1818.

    [11]Milan Houska,Eduard Brynda,Andrey Solovyev,et al.Hemocompatible albumin-heparin coatings prepared by the layer-by-layer technique.The effect of layer ordering on thrombin inhibition and platelet adhesion[J].Journal of Biomedical Materials Research Part A,2008,86A(3):769-778.

    [12]Tianfa Wen,Jianping Gao,Juyun Shen,et al.Preparation and characterization of TiO2thin films by the sol-gel process[J].Journal of Materials Science,2001,36(24):5923-5926.

    [13]Michael Gr?tzel.Sol-gel processed TiO2films for photovoltaic applications[J].Journal of Sol-Gel Science and Technology,2001,22(1/2):7-13

    [14]Xuanyong Liu,Paul K.Chu,Chuanxian Ding.Surface modification of titanium,titanium alloys,and related materials for biomedical applications[J].Materials Science and Engineering:R:Reports,2004,47(3/4):49-121.

    [15]Huang N,Yang P,Leng Y X,et al.Hemocompatibility of titanium oxide films[J].Biomaterials,2003,24(13):2177-2187.

    [16]Wang Xianghui,Zhang Feng,Li Changrong,et al.Improvement of blood compatibility of artificial heart valves via titanium oxide film coated on low temperature isotropic carbon[J].Surface and Coatings Technology,2000,128-129(1):36-42.

    [17]Chang Zhang,Jing Jin,Jie Zhao,et al.Functionalized polypropylene non-woven fabric membrane with bovine serum albumin and its hemocompatibility enhancement[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2013,102(1):45-52.

    [18]Wahid Khan,Mamta Kapoor,Neeraj Kumar.Covalent attachment of proteins to functionalized polypyrrole-coated metallic surfaces for improved biocompatibility[J].Acta Biomaterialia,2007,3(4):541-549

    [19]Jeyachandran Y L,Mielczarski J A,Mielczarski E,at al.Efficiency of blocking of non-specific interaction of different proteins by BSA adsorbed on hydrophobic and hydrophilic surfaces[J].Journal of Colloid and Interface Science,2010,341(1):136-142.

    [20]Willem Norde,Carla E Giacomelli.BSA structural changes during homomolecular exchange between the adsorbed and the dissolved states[J].Journal of Biotechnology.2000,79(3):259-268.

    猜你喜歡
    抗凝血親水性白蛋白
    雙負載抗生素親水性聚氨酯泡沫的制備與表征
    喜舒復白蛋白肽飲品助力大健康
    缺血修飾白蛋白和肌紅蛋白對急性冠狀動脈綜合征的早期診斷價值
    抗凝血類滅鼠劑中毒的診治分析
    空氣中納秒脈沖均勻DBD增加聚合物的表面親水性
    肝素抗凝血漿用于急診生化檢驗的價值分析
    藏北草原第一代抗凝血滅鼠劑應用技術研究
    西藏科技(2015年6期)2015-09-26 12:12:14
    水刺型空氣加濕器濾材的親水性改性研究
    白蛋白不可濫用
    祝您健康(2014年9期)2014-11-10 17:29:39
    Cu2+、Zn2+和 Pb2+對綠原酸與牛血清白蛋白結合作用的影響
    應用化工(2014年9期)2014-08-10 14:05:08
    老熟妇仑乱视频hdxx| 母亲3免费完整高清在线观看| 成人手机av| 人人妻人人澡人人看| 亚洲男人的天堂狠狠| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 中文字幕高清在线视频| 久久香蕉精品热| 国产av在哪里看| 男人舔女人下体高潮全视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 成年人黄色毛片网站| 色综合欧美亚洲国产小说| 麻豆一二三区av精品| 又紧又爽又黄一区二区| 日本 av在线| 午夜亚洲福利在线播放| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 午夜激情av网站| 久久欧美精品欧美久久欧美| 十八禁网站免费在线| 日本 欧美在线| 欧美丝袜亚洲另类 | 91老司机精品| 色av中文字幕| 一级毛片女人18水好多| 国产激情欧美一区二区| 窝窝影院91人妻| 午夜久久久久精精品| 天堂影院成人在线观看| 国产激情欧美一区二区| www日本在线高清视频| 又紧又爽又黄一区二区| 好男人电影高清在线观看| 久久人人精品亚洲av| 婷婷六月久久综合丁香| 99国产精品免费福利视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久亚洲真实| 亚洲人成电影免费在线| 操美女的视频在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲av电影在线进入| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 免费看a级黄色片| 此物有八面人人有两片| 国产主播在线观看一区二区| av有码第一页| 黄频高清免费视频| 夜夜爽天天搞| 成人手机av| 中出人妻视频一区二区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 51午夜福利影视在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 精品久久久久久久毛片微露脸| 精品人妻1区二区| 身体一侧抽搐| 国产99白浆流出| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 国产午夜福利久久久久久| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 中国美女看黄片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲七黄色美女视频| 满18在线观看网站| 色播亚洲综合网| 1024视频免费在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产一卡二卡三卡精品| 国产精品九九99| 久久久久久久精品吃奶| 女人精品久久久久毛片| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 黄色丝袜av网址大全| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久久久久大精品| 俄罗斯特黄特色一大片| 90打野战视频偷拍视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产99久久九九免费精品| 人人澡人人妻人| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 久久久久国产一级毛片高清牌| 操美女的视频在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美一级a爱片免费观看看 | 黄片大片在线免费观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲中文日韩欧美视频| 999久久久国产精品视频| 午夜福利,免费看| 久久久久久国产a免费观看| 一区在线观看完整版| 一级毛片精品| 亚洲自拍偷在线| 欧美激情高清一区二区三区| 国产av一区在线观看免费| 国产精品1区2区在线观看.| 国产不卡一卡二| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 超碰成人久久| av欧美777| 最近最新免费中文字幕在线| 高潮久久久久久久久久久不卡| 999久久久国产精品视频| 国产黄a三级三级三级人| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲男人的天堂狠狠| 欧美成人午夜精品| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久精品国产综合久久久| 国产三级在线视频| 大陆偷拍与自拍| 亚洲人成电影免费在线| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产高清激情床上av| 一级片免费观看大全| 正在播放国产对白刺激| 亚洲精品国产区一区二| 日韩欧美免费精品| 亚洲第一电影网av| 色哟哟哟哟哟哟| 99热只有精品国产| 99在线视频只有这里精品首页| 国产人伦9x9x在线观看| 女警被强在线播放| 日韩精品青青久久久久久| 岛国在线观看网站| 91九色精品人成在线观看| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产亚洲精品久久久久5区| 中国美女看黄片| 亚洲成a人片在线一区二区| 最新美女视频免费是黄的| 9191精品国产免费久久| 在线国产一区二区在线| 国产成人精品无人区| 99riav亚洲国产免费| 亚洲一码二码三码区别大吗| 日韩大码丰满熟妇| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产欧美日韩综合在线一区二区| www.熟女人妻精品国产| 国产99久久九九免费精品| 亚洲av成人一区二区三| 黑人操中国人逼视频| 香蕉久久夜色| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 不卡av一区二区三区| 一级黄色大片毛片| 悠悠久久av| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产精品二区激情视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 无人区码免费观看不卡| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品国产色婷婷电影| xxx96com| 韩国av一区二区三区四区| 久久久久亚洲av毛片大全| 一a级毛片在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 成人亚洲精品一区在线观看| 色播亚洲综合网| 久久久国产成人精品二区| 国产高清videossex| netflix在线观看网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 97碰自拍视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲精品美女久久av网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产精品日韩av在线免费观看 | 欧美国产日韩亚洲一区| 真人做人爱边吃奶动态| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日日爽夜夜爽网站| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 美女免费视频网站| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 午夜两性在线视频| 在线观看免费视频网站a站| 长腿黑丝高跟| 热99re8久久精品国产| 黄色a级毛片大全视频| 成人国产综合亚洲| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 很黄的视频免费| 国产精品久久电影中文字幕| 色播在线永久视频| 不卡一级毛片| 在线观看一区二区三区| 香蕉丝袜av| 欧美日韩一级在线毛片| www.熟女人妻精品国产| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产一卡二卡三卡精品| 在线观看午夜福利视频| 成人18禁在线播放| 一级黄色大片毛片| 他把我摸到了高潮在线观看| 日本免费a在线| av福利片在线| 色综合欧美亚洲国产小说| 国内精品久久久久精免费| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美日韩黄片免| 人人妻,人人澡人人爽秒播| www.999成人在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产免费av片在线观看野外av| 大陆偷拍与自拍| 午夜免费激情av| 中文字幕色久视频| 热re99久久国产66热| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲精品国产区一区二| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 午夜福利在线观看吧| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 9191精品国产免费久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日本a在线网址| 免费在线观看黄色视频的| 两个人看的免费小视频| 精品福利观看| av欧美777| 色播亚洲综合网| www.精华液| 美女国产高潮福利片在线看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲第一av免费看| 亚洲中文av在线| 久久九九热精品免费| 91大片在线观看| 少妇 在线观看| 亚洲精品国产区一区二| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产成人影院久久av| 国产精品 欧美亚洲| 99国产精品一区二区三区| 无遮挡黄片免费观看| 日本a在线网址| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 女性被躁到高潮视频| 午夜影院日韩av| 久久久精品欧美日韩精品| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国内精品久久久久精免费| 国产99白浆流出| 欧美午夜高清在线| 日韩av在线大香蕉| 老司机福利观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久久国产欧美日韩av| 色综合亚洲欧美另类图片| 69av精品久久久久久| 亚洲avbb在线观看| 久热爱精品视频在线9| 久久中文看片网| 波多野结衣一区麻豆| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲电影在线观看av| 国产精品,欧美在线| 黄片大片在线免费观看| 怎么达到女性高潮| 成人国产一区最新在线观看| or卡值多少钱| 中文字幕色久视频| 97人妻天天添夜夜摸| 午夜免费观看网址| 两性夫妻黄色片| 久久久久久久久中文| 日本五十路高清| 欧美日韩乱码在线| 成人三级做爰电影| 亚洲色图av天堂| 宅男免费午夜| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久久久久久久中文| 美女免费视频网站| av视频在线观看入口| 午夜久久久久精精品| 麻豆久久精品国产亚洲av| 色综合站精品国产| 性欧美人与动物交配| 老司机在亚洲福利影院| 久久中文看片网| 99精品久久久久人妻精品| 99久久99久久久精品蜜桃| 成人三级黄色视频| 色播亚洲综合网| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 两个人免费观看高清视频| 日韩大码丰满熟妇| 男男h啪啪无遮挡| 美女午夜性视频免费| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美精品亚洲一区二区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 欧美乱妇无乱码| 国产精品野战在线观看| 午夜福利18| 叶爱在线成人免费视频播放| 91麻豆av在线| 一二三四在线观看免费中文在| 丰满的人妻完整版| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 禁无遮挡网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 精品日产1卡2卡| av免费在线观看网站| 黄片小视频在线播放| 99香蕉大伊视频| 久久精品国产综合久久久| 国产又爽黄色视频| 丝袜人妻中文字幕| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲精品在线观看二区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久伊人香网站| 不卡一级毛片| 国产精品精品国产色婷婷| www国产在线视频色| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 宅男免费午夜| 国产麻豆成人av免费视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲av片天天在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 国产午夜精品久久久久久| 国产色视频综合| 黄色a级毛片大全视频| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲男人的天堂狠狠| 999久久久国产精品视频| 亚洲av电影在线进入| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 一级毛片高清免费大全| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲国产精品成人综合色| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| av视频在线观看入口| 亚洲情色 制服丝袜| 波多野结衣高清无吗| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲三区欧美一区| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲精品在线美女| 淫秽高清视频在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 黑丝袜美女国产一区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 妹子高潮喷水视频| 性色av乱码一区二区三区2| 天堂影院成人在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲国产精品成人综合色| 怎么达到女性高潮| 在线视频色国产色| 这个男人来自地球电影免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 真人一进一出gif抽搐免费| 在线观看舔阴道视频| 在线永久观看黄色视频| 可以在线观看的亚洲视频| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲精品粉嫩美女一区| 91麻豆av在线| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 不卡一级毛片| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美一级a爱片免费观看看 | 可以在线观看毛片的网站| 久久人人精品亚洲av| 99riav亚洲国产免费| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久狼人影院| 大香蕉久久成人网| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产亚洲欧美在线一区二区| 女人被狂操c到高潮| 亚洲精品在线美女| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产在线精品亚洲第一网站| 波多野结衣av一区二区av| 国产熟女午夜一区二区三区| 成人国产综合亚洲| 亚洲av成人av| 人妻久久中文字幕网| 悠悠久久av| 亚洲五月天丁香| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 妹子高潮喷水视频| 国产伦人伦偷精品视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 韩国精品一区二区三区| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 亚洲第一av免费看| 麻豆国产av国片精品| 久久亚洲真实| 怎么达到女性高潮| 国产一卡二卡三卡精品| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 又紧又爽又黄一区二区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 色综合婷婷激情| 国产精品久久久人人做人人爽| 最新在线观看一区二区三区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 嫁个100分男人电影在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 天堂动漫精品| 国产高清videossex| 日本欧美视频一区| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 日本一区二区免费在线视频| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲七黄色美女视频| 精品高清国产在线一区| 99在线人妻在线中文字幕| 正在播放国产对白刺激| 99re在线观看精品视频| x7x7x7水蜜桃| 亚洲中文字幕日韩| 国产成人精品久久二区二区91| 我的亚洲天堂| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 美女午夜性视频免费| 日本vs欧美在线观看视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲av第一区精品v没综合| 91九色精品人成在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 一级作爱视频免费观看| 午夜两性在线视频| 亚洲五月天丁香| 欧美激情久久久久久爽电影 | 欧美乱码精品一区二区三区| 在线天堂中文资源库| xxx96com| 一进一出好大好爽视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 精品久久久久久,| 国产国语露脸激情在线看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 1024视频免费在线观看| 搞女人的毛片| 午夜福利,免费看| 天堂影院成人在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 可以在线观看的亚洲视频| 久久精品91蜜桃| 中国美女看黄片| 美女国产高潮福利片在线看| 91成年电影在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 色综合亚洲欧美另类图片| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产一区二区三区视频了| 亚洲九九香蕉| 两个人看的免费小视频| 久久狼人影院| 国产成人欧美在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 99香蕉大伊视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| a级毛片在线看网站| 午夜福利影视在线免费观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲视频免费观看视频| 99久久综合精品五月天人人| 色在线成人网| 两人在一起打扑克的视频| 999久久久国产精品视频| 成年人黄色毛片网站| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 51午夜福利影视在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 十八禁网站免费在线| 一级毛片精品| 国产三级黄色录像| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久国产精品麻豆| 波多野结衣巨乳人妻| 色综合站精品国产| 怎么达到女性高潮| 精品人妻在线不人妻| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 老司机福利观看| 国产不卡一卡二| 午夜福利成人在线免费观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 成人国语在线视频| 村上凉子中文字幕在线| 两人在一起打扑克的视频| 午夜影院日韩av| www国产在线视频色| 久久狼人影院| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产精品久久久久久精品电影 | 国产精品一区二区在线不卡| 国产91精品成人一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲第一青青草原| 久久久久久久久免费视频了| 99精品欧美一区二区三区四区| 欧美久久黑人一区二区| 免费高清视频大片| 亚洲精品av麻豆狂野| 视频区欧美日本亚洲| 久久精品国产综合久久久| 香蕉丝袜av| 亚洲国产精品合色在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 少妇 在线观看| 大香蕉久久成人网| 动漫黄色视频在线观看| 在线观看日韩欧美| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 亚洲第一av免费看| 午夜久久久在线观看| 久热这里只有精品99| 国产在线精品亚洲第一网站| 一二三四社区在线视频社区8| 国产激情欧美一区二区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 一级毛片女人18水好多| 午夜福利免费观看在线| 亚洲午夜理论影院| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 老司机深夜福利视频在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲色图av天堂| 禁无遮挡网站| 91字幕亚洲| 桃色一区二区三区在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 少妇的丰满在线观看| 一a级毛片在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 变态另类丝袜制服| 色播在线永久视频| 性色av乱码一区二区三区2| 免费无遮挡裸体视频| 桃红色精品国产亚洲av| 国产精品综合久久久久久久免费 | 久久精品国产综合久久久| 51午夜福利影视在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 99riav亚洲国产免费| 悠悠久久av| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 美女午夜性视频免费| 久久午夜综合久久蜜桃| 黄色视频不卡| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲av熟女| 一区二区三区激情视频| 午夜老司机福利片| 巨乳人妻的诱惑在线观看|