白藜蘆醇對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及通路的影響

劉長(zhǎng)江，嚴(yán)春輝，史 斌

Department of Physical Education，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710049，Shaanxi，China

引發(fā)脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)的主要原因有交通事故(45.4%)、高處墜落(16.8%)和運(yùn)動(dòng)損傷(16.3%)等，而運(yùn)動(dòng)引起的SCI主要出現(xiàn)在跳水、摔跤、體操等項(xiàng)目上［1］。由于SCI是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病，其損傷機(jī)制歷來(lái)是骨外科、神經(jīng)外科、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)等學(xué)科研究的熱點(diǎn)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為SCI涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，如缺血、生化改變、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、毒性刺激物、神經(jīng)遞質(zhì)的積聚、脂質(zhì)過(guò)氧化和自由基的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)等［2］。尤其是近年來(lái)研究認(rèn)為SCI機(jī)制中細(xì)胞凋亡是十分重要的因素之一，但其機(jī)制仍不明確。

細(xì)胞凋亡(Apoptosis)亦稱為程序細(xì)胞死亡，是機(jī)體在自身基因控制下的細(xì)胞有序死亡方式。研究表明，SCI后神經(jīng)細(xì)胞死亡的方式不僅僅是壞死，同時(shí)還廣泛存在細(xì)胞凋亡［3］。神經(jīng)細(xì)胞的凋亡不僅參與了SCI過(guò)程，而且與多種基因的調(diào)控有關(guān)，如:Bcl－2家族、Caspase 家族及 p38MAPK 等［4－6］。如何抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕繼發(fā)性SCI，從而促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，是SCI的治療策略之一。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)具有抗氧化、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)血脂代謝、抗炎、抗腫瘤等廣泛的生理藥理學(xué)作用［7］。我們前期的研究證實(shí)Res對(duì)SCI具有保護(hù)作用［8］，但Res通過(guò)抗凋亡治療SCI的程度及作用機(jī)制還不清楚。本研究通過(guò)采用改良Allen’s重物打擊法，制成中度脊髓損傷動(dòng)物模型，觀察Res對(duì)SCI后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及其通路的影響，探討Res對(duì)SCI的抗凋亡作用及其機(jī)制，為防治SCI提供理論依據(jù)及新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

健康SD大鼠27只，體質(zhì)量(280～320)g，雌雄不限，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)時(shí)間:2011年9～12月;實(shí)驗(yàn)地點(diǎn):西安交大醫(yī)學(xué)院科研中心。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨即分為3個(gè)組:假手術(shù)組(Sham組);損傷組(Control組);白藜蘆醇處理組(Res組)，每組9只。Sham組僅行手術(shù)暴露，不給予打擊及治療;Control組、Res組采用Allen’s打擊法建立脊髓中度損傷模型，術(shù)后即刻分別給予等量的生理鹽水及Res 200 mg·kg－1。Control組注射次數(shù)和 Res組一致，每天一次，第3天處死大鼠。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置參照國(guó)家科學(xué)技術(shù)部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》［9］。

1.2 脊髓打擊損傷模型的建立

大鼠以10%水合氯醛(300 mg·kg－1)腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)，常規(guī)術(shù)區(qū)備皮，碘伏消毒皮膚，鋪無(wú)菌手術(shù)洞巾。以T8棘突為中心，取后正中縱行切口長(zhǎng)約3 cm，蚊鉗咬除T8棘突和椎板及相鄰T7－9上下各半個(gè)椎板，暴露硬脊膜。采用改良的Allen’s裝置以25 gcm(10 g×2.5 cm)損傷力度行重物打擊法制作大鼠SCI模型。造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn):損傷處脊髓出血、水腫，雙下肢呈回縮性撲動(dòng)，其尾巴出現(xiàn)痙攣性擺動(dòng)，麻醉清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓。術(shù)后0號(hào)線逐層縫合，即刻給予背外側(cè)肌群肌肉注射青霉素5萬(wàn)U預(yù)防感染，每天1次，持續(xù)3 d。分籠飼養(yǎng)，自由取食，術(shù)晨禁食水。每日膀胱按摩2次致自主排尿反射建立。組中動(dòng)物如有死亡，隨時(shí)補(bǔ)充。

1.3 主要試劑及儀器

主要試劑:白藜蘆醇(Sigma公司，批號(hào):R5010100112K5216);10%水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司，批號(hào):H37022673);青霉素注射液(蘇州二葉制藥有限公司，批號(hào):H32021320);Bcl－2、Bax、Capase－3、p38 MAPK多克隆抗體;免疫組化SP試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京博奧森公司);放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitationassay，RIPA)總蛋白提取試劑盒(日本 Takara公司);倒置顯微鏡(日本Olympus公司);EM902透射電鏡(美國(guó)Carl Zeiss公司);ECL發(fā)光液及NC膜(北京中杉金橋公司)。主要儀器:Allen’s脊髓損傷打擊器(西安交大第二附屬醫(yī)院骨科);實(shí)驗(yàn)手術(shù)器械(上海手術(shù)器械廠);Milli－QUF純水工作站(美國(guó)Millipore公司);石蠟切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)，低溫離心機(jī)(法國(guó)JOUAN公司)，80℃超低溫冰箱(美國(guó)REVECO公司)，電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技公司)，SDS－PAGE凝膠電泳儀、轉(zhuǎn)移電泳槽(美國(guó)BIO－RAD公司);倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)

1.4.1 電鏡觀察

術(shù)后72h各組取3只大鼠，給予過(guò)量乙醚麻醉處死后，取T8損傷節(jié)段脊髓組織損傷節(jié)段脊髓組織，將標(biāo)本修成1 mm3的小塊并置于2.5%戊二醛固定液中，4℃固定6 h;磷酸鹽緩沖液沖洗(pH=7.4)，1%四氧化鋨固定1 h;依次用乙醇、丙酮逐級(jí)遞增濃度脫水;環(huán)氧樹(shù)脂包埋，70℃下聚合48 h;超薄切片機(jī)連續(xù)切片，片厚60 nm;用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛溶液進(jìn)行雙重染色;透射電鏡觀察、拍照。

1.4.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

術(shù)后72 h各組取3只大鼠，同法取 T8損傷節(jié)段脊髓組織石蠟包埋、5 μm厚切片。常規(guī)脫蠟、后;熱修復(fù)抗原;每張切片加50 μl內(nèi)源性過(guò)氧化酶阻斷劑，室溫孵育10 min;PBS沖洗后，每張切片加50 μl正常非免疫動(dòng)物血清，室溫孵育10 min;甩去血清，每張切片加50 μl的兔抗鼠一抗:Bcl－2(1:100)或Bax(1:200)或Caspase－3(1:100)或p38MAPK(1:200)，4℃過(guò)夜;PBS沖洗后，每張切片加50 μl生物素的羊抗兔IgG二抗，室溫下孵育30 min;PBS沖洗后，每張切片加50 μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素溶液，室溫孵育20 min。PBS沖洗后，每張切片加100 μl新鮮配置的DAB，顯微鏡下觀察3 min，棕色為陽(yáng)性;純化水沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封固。顯微觀察陽(yáng)性表達(dá)位置及強(qiáng)度。

1.4.3 免疫印跡法(Westen blot)檢測(cè)

術(shù)后72 h各組取3只大鼠，同法取 T8損傷節(jié)段脊髓組織，RIPA試劑盒提取總蛋白，10000 g離心取上清，定量并分裝;(4:1比例樣品/上樣緩沖液)混合樣品100℃加熱變性5 min;配制10%分離膠和4%濃縮膠，上樣，10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳;根據(jù)MARKER的位置切膠，根據(jù)膠的大小裁剪 PVDF膜和濾紙，并將膜和濾紙于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸15 min，之后按濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙的順序疊放于轉(zhuǎn)膜板上夾緊，25 mV轉(zhuǎn)膜2.5h;轉(zhuǎn)膜后將 PVDF膜蛋白面朝上于8% 脫脂奶粉液中37℃ 封閉1 h。TBST漂洗三遍。棄去TBST，加一抗Bcl－2或Bax或Caspase－3或p38 MAPK(兔抗大鼠，1:200);37℃搖床搖動(dòng)2 h，4℃冰箱過(guò)夜;棄去一抗，TBST漂洗三遍;加二抗(HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，1:800);搖床溫和搖動(dòng)3 h;棄去二抗，TBST漂洗三遍，共30 min;ECL發(fā)光液發(fā)光、凝膠成像系統(tǒng)采集及分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 電鏡觀察

Sham組未檢測(cè)到凋亡細(xì)胞，Control組檢測(cè)到大量的凋亡細(xì)胞，Res組未檢測(cè)到凋亡細(xì)胞，Sham組神經(jīng)細(xì)胞核膜完整，核染色質(zhì)顆粒細(xì)致，分布均勻，線粒體膜無(wú)凹陷，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見(jiàn)擴(kuò)張改變，細(xì)胞核圓，未見(jiàn)凋亡小體產(chǎn)生。Control組神經(jīng)細(xì)胞縮小、變形，胞漿空泡化，線粒體嵴斷裂(消失)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。核膜內(nèi)陷，染色質(zhì)有邊集現(xiàn)象，有凋亡小體產(chǎn)生。Res組神經(jīng)細(xì)胞較Control組結(jié)構(gòu)清晰，染色質(zhì)較均勻，核膜清晰，少見(jiàn)核膜凹陷，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常，線粒體結(jié)構(gòu)正常。電鏡結(jié)果提示Res能明顯抑制脊髓神經(jīng)細(xì)胞的凋亡(圖1)。

圖1 脊髓損后電鏡觀察

2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

Sham組Bax呈極少量表達(dá)，Control組Bax則大量表達(dá)，Res組Bax較Control組表達(dá)明顯降低;Sham組Bcl－2呈極少量表達(dá)，Control組Bcl－2則呈極少量表達(dá)，Res組 Bcl－2表達(dá)較 Control組表達(dá)有所提高;Sham組Caspase－3、p38MAPK呈極少量表達(dá)，Control組Caspase－3、p38MAPK大量表達(dá)，Res組與 Control組相比，Caspase－3、p38MAPK表達(dá)明顯降低(圖2)。免疫組化染色提示Res對(duì)SCI組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有較好的調(diào)控作用。

2.3 免疫印跡法(westen blot)檢測(cè)

Sham組Bcl－2、Bax呈極少量表達(dá)。Bax在Control組脊髓組織中大量表達(dá)(P＜0.05)，而B(niǎo)cl－2表達(dá)較低(P＜0.05)，兩者比例失調(diào);Caspase－3及p38 MAPK明顯激活(P＜0.05)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加顯著。與Control組相比，Res組Bax蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，Bcl－2 表達(dá)則顯著升高(P ＜0.05)，Caspase－3及p38MAPK的激活明顯受到抑制(P＜0.05)。提示脊髓組織超微結(jié)構(gòu)損害有所改善，神經(jīng)細(xì)胞凋亡顯著減少(圖3、圖4)。

圖3 Westen blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖4 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

3 討論

SCI后，損傷部位除創(chuàng)傷造成的直接損傷外系列級(jí)聯(lián)放大式的繼發(fā)性病理改變(水腫、出血、鈣離子內(nèi)流、脂質(zhì)過(guò)氧化、微循環(huán)障礙、細(xì)胞凋亡等)是導(dǎo)致SCI難以治愈的關(guān)鍵。繼發(fā)性損傷不僅具有可逆性而且具有可調(diào)控性，這使得SCI的恢復(fù)具有可能［10］。此外，繼發(fā)性SCI是漸進(jìn)性的過(guò)程，為藥物治療SCI提供了機(jī)會(huì)，及時(shí)有效的干預(yù)或治療可使病變局限，從而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

隨著研究的深入，SCI的研究方向已從形態(tài)學(xué)領(lǐng)域向分子生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展。研究表明，凋亡不僅發(fā)生在發(fā)育過(guò)程中，也可發(fā)生在腦以及SCI后［11］。其后研究證實(shí)了細(xì)胞凋亡是繼發(fā)性SCI細(xì)胞死亡的重要方式［12］。影響細(xì)胞凋亡的因素有多種，如缺血、缺氧、氧自由基等，而且細(xì)胞凋亡的調(diào)控與多種基因的表達(dá)有關(guān)，如p38 MAPK信號(hào)通路、Bcl－2家族及caspase家族等。目前已知道有多種基因，如Bax、Bcl－2、Fas等均與細(xì)胞凋亡相關(guān)［13－14］，特別是 Bcl－2和 Bax基因與凋亡的調(diào)控關(guān)系更為密切，二者是相互拮抗的兩個(gè)基因，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著重要作用［15］。Bcl－2是主要的抗凋亡基因，它可以抑制多種途徑的凋亡。Bax是Bcl－2的拮抗基因，與Bcl－2具有45%的同源性，兩者都屬于Bcl－2基因家族成員，通過(guò)編碼相應(yīng)功能蛋白起作用。Bax可直接和線粒體膜結(jié)合，形成線粒體跨膜通道，促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase系統(tǒng)，進(jìn)而促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。Bax/Bcl－2異源二聚體形成的調(diào)節(jié)是細(xì)胞凋亡中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，Bax/Bcl－2比值決定細(xì)胞的存亡，SCI后Bax/Bcl－2比值增加。研究表明［16］SCI后Bcl－2蛋白僅有少量表達(dá)，而B(niǎo)ax蛋白大量表達(dá)，提示SCI后促進(jìn)凋亡因子將會(huì)占優(yōu)勢(shì)，而保護(hù)因子的明顯不足，使得神經(jīng)細(xì)胞向凋亡方向發(fā)展。

Caspases蛋白酶是目前研究的熱點(diǎn)之一，它的激活被作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志。在正常情況下，Caspase－3蛋白是以活性很低的酶原形式存在，Caspase－3被激活后，其構(gòu)象發(fā)生變化，從而發(fā)揮凋亡效應(yīng)，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生［17］。研究發(fā)現(xiàn)［18］SCI后出現(xiàn)細(xì)胞凋亡、Caspase－3的激活等，繼而脊髓內(nèi)神經(jīng)元發(fā)生一系列形態(tài)及功能變化。研究證實(shí)［19］，Caspase－3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，也是CTL細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分。因此，SCI研究中 Bax，Bcl－2，Caspase途徑是極其重要的研究途徑。有絲分裂原激酶(MAPKs)是一組參與介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)由胞外向胞內(nèi)傳遞的重要介質(zhì)，它們?cè)诩?xì)胞分化、發(fā)育、成活和凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。p38MAPK的激活是SCI引起凋亡的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，參與Bcl－2、Bax、iNOS和caspase有關(guān)細(xì)胞凋亡基因的調(diào)控。SCI激活p38MAPK，進(jìn)而活化下游的轉(zhuǎn)錄因子、MAPKAPK2，3及Caspase家族成員，活化的轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件相結(jié)合，引起大量與凋亡有關(guān)的基因表達(dá)，與細(xì)胞延遲性死亡密切相關(guān)。

繼發(fā)性SCI是漸進(jìn)性的過(guò)程，繼發(fā)性損傷不僅具有可逆性，同時(shí)具有可調(diào)控性，這為藥物治療SCI提供了機(jī)會(huì)。脊髓繼發(fā)性損傷引起的微環(huán)境變化不是單一因子作用，而是多因子、多因素聯(lián)合作用的生物共濟(jì)環(huán)，任何側(cè)重于某一方面的藥物都無(wú)法在整體上解決SCI后的修復(fù)。中藥作為傳統(tǒng)治療，由于其具有多靶點(diǎn)的綜合效應(yīng)且副作用較小等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)在SCI機(jī)理機(jī)制研究方面應(yīng)用廣泛［20－21］。Res化學(xué)名為 3，5，4’－三羥基－反－均二苯代乙烯，是廣泛存在于葡萄、花生等植物中的一種多酚類化合物，其作為植物藥，具有廣泛的生理藥理學(xué)作用［22］。本實(shí)驗(yàn)電鏡學(xué)觀察結(jié)果顯示Res可明顯抑制脊髓神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。另根據(jù) Bax，Bcl－2，Caspase－3及 p38MAPK 免疫組化染色分析及相關(guān)蛋白Western Blot檢測(cè)，我們可以初步認(rèn)為，SCI后脊髓組織內(nèi)Bcl－2表達(dá)明顯減少，Bax蛋白表達(dá)增加，誘導(dǎo)了caspase－3表達(dá)，從而導(dǎo)致了神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Res可明顯對(duì)抗上述變化。由此推測(cè)Res通過(guò)上調(diào)Bcl－2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，抑制Caspase－3激活，參與對(duì)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)。另外，損傷脊髓組織中p38MAPK的蛋白表達(dá)水平顯著增高，由此證明了損傷脊髓神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有p38 MAPK通路介入;在給予Res處理后，p38 MAPK表達(dá)下降，提示Res可抑制p38 MAPK激活，從而阻斷p38 MAPK介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，延緩損傷脊髓組織中凋亡的發(fā)生，最終及時(shí)有效的干預(yù)凋亡病變，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)論表明，Res通過(guò)提高Bcl－2/Bax蛋白表達(dá)比，抑制p38MAPK及Caspase－3的激活，使大鼠脊髓組織超微結(jié)構(gòu)損害有所改善，神經(jīng)細(xì)胞凋亡顯著減少，并且可阻斷 p38MAPK介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。提示Res對(duì)大鼠SCI組織的神經(jīng)細(xì)胞凋亡有較好的調(diào)控作用。

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