棕色田鼠睪丸和附睪胚后發(fā)育中的雌二醇表達(dá)

王慧春， 王建禮， 邰發(fā)道＊

（1陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710062；2北方民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川750021）

對雌激素（estrogen）及其受體的大量研究表明，雌激素與雄激素（androgen）一樣是雄性生殖所必需的．幼年雄性動(dòng)物缺失雌激素會(huì)直接影響成年后的生殖能力，雌、雄激素通過受體發(fā)揮協(xié)調(diào)作用共同促進(jìn)雄性生殖［1］．雌二醇（estradiol，E2）作為睪丸生精細(xì)胞存活的保護(hù)因子，比雄激素更有效，而且直接影響精子發(fā)生，抑制生精細(xì)胞的凋亡［2］．嚙齒動(dòng)物睪丸中生殖干細(xì)胞的數(shù)量和精子的成熟受到雌激素調(diào)控［3－4］．給予高劑量的植物雌激素大豆黃酮能夠延擱大鼠睪丸的生長和發(fā)育，并誘導(dǎo)青春期大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)改變［5］．產(chǎn)后1d的大鼠幼仔每日給予1μg的17－β－雌二醇后，觀察產(chǎn)后3d、5d、8d、10d和16d的生殖母細(xì)胞分化，發(fā)現(xiàn)外源性雌激素會(huì)改變生殖母細(xì)胞向生精小管基層的遷移，可減少細(xì)胞增生和增加程序性死亡，而生殖母細(xì)胞的遷移和其后的增生對于生殖細(xì)胞的存活是必需的［6］．Pelletier等利用免疫組化和原位雜交研究表明，大鼠的次級精母細(xì)胞和精子細(xì)胞有雌激素α受體（ERα）和ERαmRNA表達(dá)［7］．ERα在偶線期和早粗線期的初級精母細(xì)胞及早期的長形精子細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)烈［2］．對ERα基因敲除（ErαKO）的雄性小鼠研究證實(shí)，雌激素還可以通過影響睪丸輸出小管的形態(tài)結(jié)構(gòu)和輸出小管的重吸收功能來間接影響睪丸的發(fā)育和精子發(fā)生［8－10］．這些實(shí)驗(yàn)說明雌激素可以從多方面影響睪丸的發(fā)育和精子發(fā)生．但在胚后不同發(fā)育階段的睪丸中，內(nèi)源性雌激素在各級生精細(xì)胞的表達(dá)及對精子發(fā)生的調(diào)控還不清楚．棕色田鼠（Microtus mandarinus）主要生活于農(nóng)田果園，營半地下生活，對農(nóng)作物及果樹造成很大危害．此前，我們曾對棕色田鼠胚后發(fā)育的睪丸和附睪內(nèi)ERα和雄激素受體（AR）的分布和表達(dá)進(jìn)行了研究［11－12］，為了進(jìn)一步探討雌激素在胚后發(fā)育中精子發(fā)生、發(fā)育中的調(diào)控作用，并為從激素角度控制害鼠提供依據(jù)，我們對從出生到成體不同發(fā)育階段的棕色田鼠睪丸和附睪組織內(nèi)的E2表達(dá)進(jìn)行了研究．

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物取材與切片制備

棕色田鼠捕自河南省靈寶市農(nóng)作區(qū)（東經(jīng)111°21′，北緯34°41′，海拔650m）．不同洞群捕捉的雌、雄鼠進(jìn)行配對．塑料飼養(yǎng)籠（0．4m×0．28m×0．15 m）飼養(yǎng)，木屑做墊料，棉花做巢材，以兔飼料搭配胡蘿卜、麥芽為食．室溫23±1℃，光照周期12L：12D（光周期：07：00—19：00），食物、飲水充足．實(shí)驗(yàn)鼠分別為產(chǎn)后1日齡、10日齡、25日齡、45日齡和60日齡（成體）的雄性鼠，每組6只．幼仔日齡以分娩當(dāng)日為0日計(jì)算．稱重后用4mg／mL戊巴比妥鈉麻醉（1mg／100g體重），4%的多聚甲醛灌流固定后，摘取睪丸及附睪，固定于改良的Bouins液．脫水、透明，常規(guī)石蠟切片，制成6μm的連續(xù)切片，切片裱于覆有多聚賴氨酸的載玻片上，恒溫箱烤干．

1．2 免疫組織化學(xué)染色

切片脫蠟復(fù)水后，用1%甲醇－過氧化氫液孵育30min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶．然后進(jìn)行熱修復(fù)抗原，SABC試劑盒（武漢博士德生物工程公司）中的抗原修復(fù)液在室溫條件下修復(fù)抗原10min，經(jīng)山羊血清于37℃孵育30min后，加入E2兔抗多克隆抗體（1∶1 500稀釋，美國Sigma公司）置于4℃冰箱過夜，再加入生物素化羊抗兔IgG，室溫孵育2h，最后加入試劑盒中的SABC孵育1h，經(jīng)DAB（武漢博士德生物工程公司）顯色，蒸餾水充分沖洗終止反應(yīng)．以上各步驟間均用0．01mol／L的PBS沖洗3次，每次5min．然后按常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，光鏡觀察并照像．陰性對照組用0．01mol／L的PBS替代一抗進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，其他步驟同實(shí)驗(yàn)組．

1．3 圖像及數(shù)據(jù)分析

用Qwin V3圖像分析系統(tǒng)（Lecia）對免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行灰度值測試．每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取3張切片，每張切片測試10個(gè)陽性細(xì)胞的灰度值．3張切片陽性細(xì)胞的平均灰度值作為每只動(dòng)物原始數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行組間比較．測量的灰度值越小，陽性反應(yīng)越強(qiáng)．?dāng)?shù)據(jù)采用SPSS for windows 10．0軟件進(jìn)行處理，通過t檢驗(yàn)和One－way Anova進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，在P＜0．05時(shí)，選擇Post－Hoc檢驗(yàn)中LSD法進(jìn)行多重比較．結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（Mean±SE）．

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1日齡，睪丸生精小管內(nèi)生殖母細(xì)胞有E2陽性反應(yīng)．10日齡，生殖母細(xì)胞陽性反應(yīng)減弱（P＜0．05）．25日齡E2陽性表達(dá)主要見于精子細(xì)胞；45日齡，精子細(xì)胞和精母細(xì)胞中有E2的表達(dá)．成體生精小管中精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子中均有E2表達(dá)，精母細(xì)胞和精子細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)，精原細(xì)胞表達(dá)較弱．1日齡和10日齡的間質(zhì)區(qū)細(xì)胞E2表達(dá)最強(qiáng)，25日齡和45日齡表達(dá)明顯減弱，成體間質(zhì)細(xì)胞E2表達(dá)最弱（P＜0．05）（圖1，表1）．

1日齡至45日齡，E2的表達(dá)主要集中在附睪上皮細(xì)胞和連接組織，25日齡E2表達(dá)微弱．成體，E2除在上皮細(xì)胞和連接組織表達(dá)外，附睪管中的大量精子表達(dá)明顯（圖2）．

圖1 不同日齡棕色田鼠睪丸內(nèi)雌二醇的表達(dá)Fig．1 Estradiol expression in testes of mandarin voles（Microtus mandarinus）with different age

表1 棕色田鼠胚后發(fā)育中睪丸生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的E2表達(dá)（Mean±SE）Tab．1 Immunohistochemistry expression of estradiol in spermatogenic cells and leydig cells of mandarin voles testes during postnatal development（Mean±SE）

圖2 不同日齡棕色田鼠附睪內(nèi)雌二醇的表達(dá)Fig．2 Estradiol expression in epididymides of mandarin voles（Microtus mandarinus）with different age

3 討論

RT－PCR技術(shù)研究表明，大鼠的間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子中有細(xì)胞色素P450芳香化酶mRNA表達(dá)［13］，表明睪丸內(nèi)除體細(xì)胞外，生殖細(xì)胞也可以合成E2．本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在棕色田鼠胚后發(fā)育中，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞及精子中均有E2表達(dá)，說明各級生精細(xì)胞均可能有E2生成．1日齡的雄性大鼠幼仔，生殖母細(xì)胞增生并且移向生精小管基層，這個(gè)過程有利于精子發(fā)生并且受到雌激素的調(diào)節(jié)［6］．1日齡的棕色田鼠有E2陽性反應(yīng)，說明雌激素對生殖母細(xì)胞的分化有調(diào)節(jié)作用．結(jié)合此前研究棕色田鼠胚后發(fā)育中生精細(xì)胞ERα的增齡變化［11］，我們發(fā)現(xiàn)E2的表達(dá)與ERα的表達(dá)基本一致，推測E2可能通過ERα調(diào)控生精細(xì)胞的增殖分裂．ERαKO的成年雄性小鼠精子數(shù)目減少，形態(tài)異常，生殖能力下降，說明ERα介導(dǎo)的雌激素作用有利于精子發(fā)生［14］．實(shí)驗(yàn)中25日齡和45日齡生精小管內(nèi)精子細(xì)胞中有E2表達(dá)，一直持續(xù)到性成熟．說明棕色田鼠性成熟過程中，在精子發(fā)生的各階段需要雌激素的調(diào)控．雌激素在精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子形成中具有直接的調(diào)控作用，而且雌激素具有防止未變態(tài)精子細(xì)胞凋亡、維持成熟精子功能的作用［15］．因此，棕色田鼠睪丸胚后發(fā)育過程中，E2對生殖細(xì)胞的分化增殖有重要作用．

間質(zhì)細(xì)胞除生成雄激素外，也是生成E2的主要來源細(xì)胞［16］．在棕色田鼠胚后發(fā)育過程中，E2在間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)也間接證明了這一點(diǎn)．結(jié)合對棕色田鼠生精細(xì)胞ERα的研究［11］．可以推測ERα介導(dǎo)雌激素調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育．與生精細(xì)胞不同，不同日齡間質(zhì)細(xì)胞的E2和ERα的表達(dá)強(qiáng)度并不一致．這是由于受體具有精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制，受體隨時(shí)與不斷變化的配體及核膜微環(huán)境發(fā)生相互作用，并發(fā)生自適性地改變，致使受體的數(shù)量和反應(yīng)性不斷處于可塑性變換之中，可能上調(diào)也可能下調(diào)［17］．ERα表達(dá)強(qiáng)度的變化反應(yīng)了其對雌激素的反應(yīng)性．而且，雌激素對間質(zhì)細(xì)胞的分化作用依賴于間質(zhì)細(xì)胞所處的階段［18］．大鼠出生后第5天注射E2后，到60日齡時(shí)睪丸中沒有成熟的間質(zhì)細(xì)胞，說明性成熟前間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育受到E2的抑制．E2可以通過ERα介導(dǎo)抑制間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育從而減少睪酮的分泌［19］．ERα可以通過雌激素反映元件依賴式的機(jī)制和雌激素反映元件非依賴式的機(jī)制起作用，后者能影響間質(zhì)細(xì)胞睪酮的生物合成［20］．間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的睪酮通過滲透作用進(jìn)入生精小管，在支持細(xì)胞內(nèi)由芳香化酶催化生成E2，E2在生精小管內(nèi)擴(kuò)散，作用于生精細(xì)胞從而調(diào)控生精過程［13］．因此，E2通過抑制間質(zhì)細(xì)胞睪酮的分泌，實(shí)現(xiàn)自反饋，從而精確地調(diào)節(jié)精子發(fā)生．

1日齡至成體的棕色田鼠附睪上皮細(xì)胞和連接組織均有E2表達(dá)，25日齡的E2表達(dá)微弱，成體附睪管中有大量精子，且有明顯的E2表達(dá)．而且1日齡至成體附睪上皮細(xì)胞也有ERα表達(dá)［11］．ERαKO的雄性小鼠生殖管道畸變，說明雌激素參與對生殖道上皮的形態(tài)構(gòu)建［21］．E2可能通過ERα的介導(dǎo)影響棕色田鼠附睪的發(fā)育，并且影響精子的成熟．

4 結(jié)論

棕色田鼠從出生至性成熟，睪丸內(nèi)生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均有不同程度的E2表達(dá)．一方面，間接說明這兩類細(xì)胞是E2生成的重要位點(diǎn)；另一方面，E2在各級生精細(xì)胞及附睪上皮細(xì)胞的表達(dá)，說明生精細(xì)胞的分化增殖和精子的成熟都可能受其直接調(diào)控．E2也可以通過調(diào)控間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育，調(diào)節(jié)精子發(fā)生．

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