針刺對大鼠顱腦損傷后Nogo-A表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

田貴華，王錫友，姚海江，李志剛

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院推拿科,北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，影響顱腦損傷（CCI）后中樞神經(jīng)修復(fù)的因素主要包括神經(jīng)營養(yǎng)因子（NTF）缺乏、軸突生長抑制因子和軸突導(dǎo)向因子等[1-4]。軸突生長抑制因子是目前顱腦損傷研究的熱點(diǎn)之一[5]。

Nogo-A作為軸突生長抑制因子Nogo的異構(gòu)體之一，其對軸突再生的抑制作用最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)采用針刺顱腦損傷大鼠督脈上的“百會”、“人中”兩穴進(jìn)行干預(yù)治療，運(yùn)用免疫組化方法對各組大鼠腦組織軸突再生抑制因子nogo-A的蛋白表達(dá)含量進(jìn)行檢測，分析針刺對顱腦損傷大鼠損傷腦組織軸突再生抑制因子nogo-A蛋白表達(dá)的影響，從而對針刺治療顱腦損傷的機(jī)制進(jìn)行研究分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠（由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），180只，體質(zhì)量250~280 g。適應(yīng)環(huán)境3 d后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，適應(yīng)期間采用12 h明/暗周期（早 7∶00~晚 7∶00）照明，自由飲水進(jìn)食。根采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為3組，即電針組、模型對照組、正常對照組，每組60只，然后再將每組隨機(jī)分成 6h、1d、6d、12d，4 個(gè)時(shí)間組，每個(gè)時(shí)間組12只。

1.1.2 針具 用華佗牌無菌針灸針，規(guī)格為0.30mm×13 mm。電針采用用韓氏（HANS）電針儀，型號為LH-402H，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部神經(jīng)科學(xué)研究所監(jiān)制。

1.2 方法

1.2.1 顱腦損傷模型制備 參照Feeney等研制的鼠顱腦創(chuàng)傷模具進(jìn)行改進(jìn)設(shè)計(jì)打擊裝置,對模型組和針刺組大鼠造成左頂葉局限性腦挫裂傷。術(shù)前大鼠禁食8 h，經(jīng)40%氟烷誘導(dǎo)麻醉后稱體質(zhì)量，然后腹腔注射濃度為10 g/L的戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，麻醉成功后俯臥位固定。用8%Na2S清除手術(shù)部位鼠毛并消毒皮膚，正中切開，剝離骨膜，暴露左頂骨，用牙科鉆在冠狀縫后1.5 mm，中線旁2.5 mm處鉆一直徑5 mm骨窗，保持硬膜完整。將撞桿置于硬膜上，用20 g砝碼置于30 cm高處沿外周導(dǎo)管墜落，撞擊撞桿從而撞擊硬膜，造成中度顱腦損傷。按神經(jīng)功能損傷程度評分（NSS）簡易準(zhǔn)則評估，分值為4~6者屬中度損傷，提示造模成功。打擊后切口內(nèi)滴注4萬單位硫酸慶大霉素4~5滴，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。正常對照組不予處理[6]。

1.2.2 行為學(xué)觀察 各組手術(shù)后，分別于6h、1d、6d、12 d進(jìn)行行為學(xué)觀察。參照NSS制定簡易評估準(zhǔn)則得分越高，說明顱腦損傷越重。神經(jīng)損傷傷情共包括10項(xiàng)，提尾時(shí)后腿屈曲、不能在地上直線行走、翻正反射（righting reflex）消失、肢體位置反射（placing reflex）消失、驚嚇反射消失、無尋覓行為、俯臥、不能完全伸直其前肢、木條平衡作業(yè)少于60秒（1cm寬）、不能在4 cm寬木條上行走，每項(xiàng)各1分，共10分。

1.2.3 治療方法 于造模后即刻以1寸（同身寸，下同）毫針針刺“人中”、“百會”兩穴，將針柄分別連接至電針儀的電極上，“百會”穴接陰極，“人中”穴接陽極，持續(xù)脈沖電流，頻率2 Hz，強(qiáng)度2 mA，時(shí)間為30 min。正常組和模型組在治療時(shí)間均要抓取1次，以保證和針刺組大鼠的條件相同。電針組中的各時(shí)間點(diǎn)組于每天同一時(shí)間點(diǎn)治療1次。

1.2.4 標(biāo)本制備 各時(shí)間點(diǎn)組（6h、1d、6d、12d）大鼠分別于手術(shù)后6 h、1 d、6 d、12 d斷頭處死，在冰片上迅速取出損傷部位腦組織，然后用-4℃的生理鹽水沖洗干凈后置凍存管，迅速投入液氮保存待測。

1.2.5 免疫組化 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟處理后，3%H2O2避光浸泡30 min，枸椽酸緩沖液行抗原修復(fù)。3%正常兔血清37℃孵育30 min，羊抗人在37℃孵育2 h或孵育30 min后放入4℃冰箱過夜；生物素標(biāo)記的兔抗羊IgG 37℃孵育30 min；辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液。37℃孵育30 min后DAB顯色試劑盒顯色。蘇木精復(fù)染。常規(guī)脫水，透明，封片[6]。

1.3 圖像處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用ipp6.1圖像分析系統(tǒng)，各組每只大鼠取5張切片，隨機(jī)視野中陽性反應(yīng)細(xì)胞測其灰度值，每張片隨機(jī)取5個(gè)視野，取其均值作為每一例的平均灰度。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 18.0軟件。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。3組之間整體比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 Nogo-A蛋白表達(dá)圖像分析結(jié)果 見表1。

表1 顱腦組織中Nogo-A蛋白表達(dá)圖像分析結(jié)果（±s）Tab.1 The image analysis results of the protein expression of Nogo-A in craniocerebral tissue（±s）

表1 顱腦組織中Nogo-A蛋白表達(dá)圖像分析結(jié)果（±s）Tab.1 The image analysis results of the protein expression of Nogo-A in craniocerebral tissue（±s）

注：與模型組比較*P<0.05,**P<0.01，與空白組比較#P<0.05，##P<0.01。

組別 n 6 h n 24 h n 48 h 6 d模型組 10 213.973±57.640 10 258.583±42.047 9 541.796±186.832 530.758±159.812空白組 11 164.366±17.005** 11 164.366±17.005* 11 164.366±17.005** 164.366±17.005**電針組 09 640.991±144.238**## 11 368.708±53.727**## 10 333.170±90.058**## 213.428±54.840**

2.2 免疫組化結(jié)果 見圖1。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為顱腦損傷的病機(jī)為氣機(jī)逆亂氣滯、經(jīng)絡(luò)阻滯，主要病理因素為水停、瘀血、痰濕，各因素互為因果從而造成患者神志、語言及運(yùn)動(dòng)等方面的障礙。治療原則為活血化瘀、化痰開竅、疏通經(jīng)絡(luò)?！鞍贂?、“人中”為督脈之要穴，“百會”為足太陽經(jīng)、手足少陽經(jīng)、足厥陰經(jīng)與督脈之會，能升清化瘀，有助于瘀血的消散和吸收，更可補(bǔ)神益智，疏通腦絡(luò)?！叭酥小笔鞘?、足陽明經(jīng)與督脈之會，為危急病癥的常用針刺急救穴位，可明顯地促進(jìn)腦血循環(huán)，增加腦灌注量，改善微循環(huán)障礙。督脈電針，不但可以調(diào)節(jié)督脈經(jīng)氣、疏通氣血，還是一種脈沖電場，具有針刺和電場雙重作用。臨床實(shí)踐及實(shí)驗(yàn)證明[1-2]電針能促進(jìn)CCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）損傷后產(chǎn)生的大量軸突生長抑制因子，是阻礙CNS再生的重要原因。它具有3種主要異構(gòu)體，分別是Nogo-A,Nogo-B和Nogo-C，其中以Nogo-A與神經(jīng)再生的關(guān)系最為密切，是作用最強(qiáng)烈的神經(jīng)再生抑制物質(zhì)[7]。Nogo-A在大鼠生長發(fā)育階段表達(dá)明顯，在神經(jīng)發(fā)展成熟后，其在腦內(nèi)呈低水平表達(dá)，當(dāng)神經(jīng)組織損傷重建時(shí)，Nogo-A的表達(dá)可再次增強(qiáng)[8-10]。研究表明,腦組織內(nèi)Nogo-A的表達(dá)量在顱腦損傷后的早期即發(fā)生改變，這一變化伴隨急性顱腦損傷的整個(gè)過程，并且與顱腦損傷的輕重程度以及損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的好壞密切相關(guān)。Nogo-A作為中樞神經(jīng)軸突生長抑制因子最為重要的一個(gè),也是反映急性顱腦損傷后腦組織病理改變的敏感指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)觀察到，在正常成年大鼠（空白組）顱腦細(xì)胞中，Nogo-A蛋白表達(dá)較低，顱腦損傷后的6 h、24 h、48 h和6d Nogo-A蛋白表達(dá)顯著升高，炎性細(xì)胞開始在損傷周圍浸潤。此時(shí)損傷位點(diǎn)上方前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中Nogo-A蛋白表達(dá)明顯增加，而針刺組6 h顯著升高，從24 h開始，Nogo-A表達(dá)逐漸開始下降，48 h、6 d時(shí)，Nogo-A蛋白的表達(dá)都顯著低于模型組。這提示，電針治療對大鼠脊髓損傷后Nogo-A蛋白表達(dá)具有明顯的抑制作用。電針促進(jìn)顱腦損傷大鼠神經(jīng)修復(fù)的機(jī)制可能涉及很多方面，依據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以證實(shí)下調(diào)Nogo-A蛋白表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)再生可能是其重要機(jī)制之一。

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圖1 3組不同時(shí)間免疫組化結(jié)果Fig.1 The results of immunohistoche mistry at different time among 3 groups