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    針刺對大鼠顱腦損傷后Nogo-A表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

    2013-10-28 08:57:40田貴華王錫友姚海江李志剛
    天津中醫(yī)藥 2013年10期
    關(guān)鍵詞:督脈孵育電針

    田貴華,王錫友,姚海江,李志剛

    (1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院推拿科,北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,北京 100029)

    現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),影響顱腦損傷(CCI)后中樞神經(jīng)修復(fù)的因素主要包括神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)缺乏、軸突生長抑制因子和軸突導(dǎo)向因子等[1-4]。軸突生長抑制因子是目前顱腦損傷研究的熱點(diǎn)之一[5]。

    Nogo-A作為軸突生長抑制因子Nogo的異構(gòu)體之一,其對軸突再生的抑制作用最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)采用針刺顱腦損傷大鼠督脈上的“百會”、“人中”兩穴進(jìn)行干預(yù)治療,運(yùn)用免疫組化方法對各組大鼠腦組織軸突再生抑制因子nogo-A的蛋白表達(dá)含量進(jìn)行檢測,分析針刺對顱腦損傷大鼠損傷腦組織軸突再生抑制因子nogo-A蛋白表達(dá)的影響,從而對針刺治療顱腦損傷的機(jī)制進(jìn)行研究分析。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠(由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),180只,體質(zhì)量250~280 g。適應(yīng)環(huán)境3 d后進(jìn)入實(shí)驗(yàn),適應(yīng)期間采用12 h明/暗周期(早 7∶00~晚 7∶00)照明,自由飲水進(jìn)食。根采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為3組,即電針組、模型對照組、正常對照組,每組60只,然后再將每組隨機(jī)分成 6h、1d、6d、12d,4 個(gè)時(shí)間組,每個(gè)時(shí)間組12只。

    1.1.2 針具 用華佗牌無菌針灸針,規(guī)格為0.30mm×13 mm。電針采用用韓氏(HANS)電針儀,型號為LH-402H,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部神經(jīng)科學(xué)研究所監(jiān)制。

    1.2 方法

    1.2.1 顱腦損傷模型制備 參照Feeney等研制的鼠顱腦創(chuàng)傷模具進(jìn)行改進(jìn)設(shè)計(jì)打擊裝置,對模型組和針刺組大鼠造成左頂葉局限性腦挫裂傷。術(shù)前大鼠禁食8 h,經(jīng)40%氟烷誘導(dǎo)麻醉后稱體質(zhì)量,然后腹腔注射濃度為10 g/L的戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉,麻醉成功后俯臥位固定。用8%Na2S清除手術(shù)部位鼠毛并消毒皮膚,正中切開,剝離骨膜,暴露左頂骨,用牙科鉆在冠狀縫后1.5 mm,中線旁2.5 mm處鉆一直徑5 mm骨窗,保持硬膜完整。將撞桿置于硬膜上,用20 g砝碼置于30 cm高處沿外周導(dǎo)管墜落,撞擊撞桿從而撞擊硬膜,造成中度顱腦損傷。按神經(jīng)功能損傷程度評分(NSS)簡易準(zhǔn)則評估,分值為4~6者屬中度損傷,提示造模成功。打擊后切口內(nèi)滴注4萬單位硫酸慶大霉素4~5滴,骨蠟封閉骨窗,縫合頭皮。正常對照組不予處理[6]。

    1.2.2 行為學(xué)觀察 各組手術(shù)后,分別于6h、1d、6d、12 d進(jìn)行行為學(xué)觀察。參照NSS制定簡易評估準(zhǔn)則得分越高,說明顱腦損傷越重。神經(jīng)損傷傷情共包括10項(xiàng),提尾時(shí)后腿屈曲、不能在地上直線行走、翻正反射(righting reflex)消失、肢體位置反射(placing reflex)消失、驚嚇反射消失、無尋覓行為、俯臥、不能完全伸直其前肢、木條平衡作業(yè)少于60秒(1cm寬)、不能在4 cm寬木條上行走,每項(xiàng)各1分,共10分。

    1.2.3 治療方法 于造模后即刻以1寸(同身寸,下同)毫針針刺“人中”、“百會”兩穴,將針柄分別連接至電針儀的電極上,“百會”穴接陰極,“人中”穴接陽極,持續(xù)脈沖電流,頻率2 Hz,強(qiáng)度2 mA,時(shí)間為30 min。正常組和模型組在治療時(shí)間均要抓取1次,以保證和針刺組大鼠的條件相同。電針組中的各時(shí)間點(diǎn)組于每天同一時(shí)間點(diǎn)治療1次。

    1.2.4 標(biāo)本制備 各時(shí)間點(diǎn)組(6h、1d、6d、12d)大鼠分別于手術(shù)后6 h、1 d、6 d、12 d斷頭處死,在冰片上迅速取出損傷部位腦組織,然后用-4℃的生理鹽水沖洗干凈后置凍存管,迅速投入液氮保存待測。

    1.2.5 免疫組化 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟處理后,3%H2O2避光浸泡30 min,枸椽酸緩沖液行抗原修復(fù)。3%正常兔血清37℃孵育30 min,羊抗人在37℃孵育2 h或孵育30 min后放入4℃冰箱過夜;生物素標(biāo)記的兔抗羊IgG 37℃孵育30 min;辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液。37℃孵育30 min后DAB顯色試劑盒顯色。蘇木精復(fù)染。常規(guī)脫水,透明,封片[6]。

    1.3 圖像處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用ipp6.1圖像分析系統(tǒng),各組每只大鼠取5張切片,隨機(jī)視野中陽性反應(yīng)細(xì)胞測其灰度值,每張片隨機(jī)取5個(gè)視野,取其均值作為每一例的平均灰度。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 18.0軟件。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。3組之間整體比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有顯著性。

    2 結(jié)果

    2.1 Nogo-A蛋白表達(dá)圖像分析結(jié)果 見表1。

    表1 顱腦組織中Nogo-A蛋白表達(dá)圖像分析結(jié)果(±s)Tab.1 The image analysis results of the protein expression of Nogo-A in craniocerebral tissue(±s)

    表1 顱腦組織中Nogo-A蛋白表達(dá)圖像分析結(jié)果(±s)Tab.1 The image analysis results of the protein expression of Nogo-A in craniocerebral tissue(±s)

    注:與模型組比較*P<0.05,**P<0.01,與空白組比較#P<0.05,##P<0.01。

    組別 n 6 h n 24 h n 48 h 6 d模型組 10 213.973±57.640 10 258.583±42.047 9 541.796±186.832 530.758±159.812空白組 11 164.366±17.005** 11 164.366±17.005* 11 164.366±17.005** 164.366±17.005**電針組 09 640.991±144.238**## 11 368.708±53.727**## 10 333.170±90.058**## 213.428±54.840**

    2.2 免疫組化結(jié)果 見圖1。

    3 討論

    中醫(yī)學(xué)認(rèn)為顱腦損傷的病機(jī)為氣機(jī)逆亂氣滯、經(jīng)絡(luò)阻滯,主要病理因素為水停、瘀血、痰濕,各因素互為因果從而造成患者神志、語言及運(yùn)動(dòng)等方面的障礙。治療原則為活血化瘀、化痰開竅、疏通經(jīng)絡(luò)?!鞍贂?、“人中”為督脈之要穴,“百會”為足太陽經(jīng)、手足少陽經(jīng)、足厥陰經(jīng)與督脈之會,能升清化瘀,有助于瘀血的消散和吸收,更可補(bǔ)神益智,疏通腦絡(luò)?!叭酥小笔鞘?、足陽明經(jīng)與督脈之會,為危急病癥的常用針刺急救穴位,可明顯地促進(jìn)腦血循環(huán),增加腦灌注量,改善微循環(huán)障礙。督脈電針,不但可以調(diào)節(jié)督脈經(jīng)氣、疏通氣血,還是一種脈沖電場,具有針刺和電場雙重作用。臨床實(shí)踐及實(shí)驗(yàn)證明[1-2]電針能促進(jìn)CCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)。

    中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷后產(chǎn)生的大量軸突生長抑制因子,是阻礙CNS再生的重要原因。它具有3種主要異構(gòu)體,分別是Nogo-A,Nogo-B和Nogo-C,其中以Nogo-A與神經(jīng)再生的關(guān)系最為密切,是作用最強(qiáng)烈的神經(jīng)再生抑制物質(zhì)[7]。Nogo-A在大鼠生長發(fā)育階段表達(dá)明顯,在神經(jīng)發(fā)展成熟后,其在腦內(nèi)呈低水平表達(dá),當(dāng)神經(jīng)組織損傷重建時(shí),Nogo-A的表達(dá)可再次增強(qiáng)[8-10]。研究表明,腦組織內(nèi)Nogo-A的表達(dá)量在顱腦損傷后的早期即發(fā)生改變,這一變化伴隨急性顱腦損傷的整個(gè)過程,并且與顱腦損傷的輕重程度以及損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的好壞密切相關(guān)。Nogo-A作為中樞神經(jīng)軸突生長抑制因子最為重要的一個(gè),也是反映急性顱腦損傷后腦組織病理改變的敏感指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)觀察到,在正常成年大鼠(空白組)顱腦細(xì)胞中,Nogo-A蛋白表達(dá)較低,顱腦損傷后的6 h、24 h、48 h和6d Nogo-A蛋白表達(dá)顯著升高,炎性細(xì)胞開始在損傷周圍浸潤。此時(shí)損傷位點(diǎn)上方前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中Nogo-A蛋白表達(dá)明顯增加,而針刺組6 h顯著升高,從24 h開始,Nogo-A表達(dá)逐漸開始下降,48 h、6 d時(shí),Nogo-A蛋白的表達(dá)都顯著低于模型組。這提示,電針治療對大鼠脊髓損傷后Nogo-A蛋白表達(dá)具有明顯的抑制作用。電針促進(jìn)顱腦損傷大鼠神經(jīng)修復(fù)的機(jī)制可能涉及很多方面,依據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以證實(shí)下調(diào)Nogo-A蛋白表達(dá),促進(jìn)神經(jīng)再生可能是其重要機(jī)制之一。

    [1]李志剛,劉書坤.近十年電針治療脊髓損傷的臨床和實(shí)驗(yàn)研究概況[J].中國中醫(yī)藥科技2004,11(6):386-388.

    [2]韓清民,謝杰,柴生顫,等.電針督脈對實(shí)驗(yàn)性脊髓損傷大鼠水通道蛋白-4的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,7(25):637-639.

    [3]Wang K H,Brose K,Arnott D,et al.Biochemical purification of amammalian slit protein as a positive regulator of sensory axonelongation and branching[J].Cell,1999:771-784.

    [4]孫 青,田國慶.糖尿病腦病發(fā)病機(jī)制及藥物干預(yù)概況[J].中華中醫(yī)藥雜志,2009,24(4):502-505.

    [5]Juri R,Matthias M.What does it mean to identify a protein in proteomics Trends in Biochemical Sciences[J].2002,27(2):74.

    [6]田貴華,譚純,姚海江,等.針刺對大鼠顱腦損傷后軸突導(dǎo)向因子Slit2表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2011,26(5):1197-1200.

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    圖1 3組不同時(shí)間免疫組化結(jié)果Fig.1 The results of immunohistoche mistry at different time among 3 groups

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