茶葉中阿維菌素和吡蟲啉殘留量的測定

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湛江524001)

1 前言

吡蟲啉(imidacloprid)又叫滅蟲精，是新一代硝基亞甲基類內(nèi)吸殺蟲劑[1]，具有廣譜、高效、低毒、低殘留，害蟲不易產(chǎn)生抗性，并有觸殺、胃毒和內(nèi)吸多重藥效。吡蟲啉近年在我國茶葉種植生產(chǎn)中應(yīng)用十分廣泛,主要用以防治小綠葉蟬、黑刺粉虱等刺吸式口器害蟲。阿維菌素(abamectin)是由放線菌產(chǎn)生的一種安全、高效、廣譜的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[2,3]，廣泛用于蔥、西蘭花、甘藍等出口蔬菜和茶葉上。在14、25和35℃下吡蟲啉在油菜葉面消解的半衰期分別為8.7、3.8和2.9天[4]，推薦使用劑量、2倍推薦使用劑量和4倍推薦使用劑量使用后阿維菌素在廣州小白菜中的半衰期為1～2d[5]。按世界衛(wèi)生組織(WHO)的5級分級標(biāo)準(zhǔn)，阿維菌素屬于高毒化合物。歐盟法規(guī)(EC)規(guī)定了茶葉中阿維菌素和吡蟲啉的最大殘留限量(MRL)分別為0.02 mg /kg和0.05mg /kg，日本則不允許將阿維菌素用于茶葉種植中，日本肯定列表中茶葉中的限量標(biāo)準(zhǔn)為10 mg/kg。然而，隨著我國茶葉出口量逐年增長，為應(yīng)對國際貿(mào)易壁壘，急需建立同時檢測吡蟲啉和阿維菌素的高靈敏度方法。

目前，食品中吡蟲啉的測定方法的主要有液相色譜法[6-10]和氣質(zhì)譜聯(lián)用法[11]，阿維菌素的測定方法主要是高效液相色譜熒光法[12,13]和高效液相色譜紫外法[14,15]。以往的方法靈敏度低，無法跟國際接軌。本方法的建立旨在建立一個同時測定茶葉中吡蟲啉和阿維菌素的測定方法。目標(biāo)物經(jīng)乙腈提取，氨基炭黑柱凈化，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法同時測茶葉中吡蟲啉和阿維菌素的殘留量。方法靈敏度高，分析速度快。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

Waters ACQUITY UPLCTM-TQD MS/MS系統(tǒng)(美國waters)；高速勻質(zhì)機(德國IKA)；氮吹儀(美國Organomation)；離心機(日本日立)；漩渦混合器(德國IKA)；電子天平(FA1104，上海天平儀器廠)等。

阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品；吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品(95%)；乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)；乙腈(分析純)；固相萃取小柱：氨基炭黑柱(500 mg/6 mL)；水為二次蒸餾水。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱量50.0 mg阿維菌素和吡蟲啉原藥于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇(色譜純)溶解并定容，配制成500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取阿維菌素和吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別用甲醇稀釋配制成5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)液相色譜測定后建立兩種目標(biāo)物濃度與峰面積的回歸方程。

2.4 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：UPLC ACQUITY BEH，50×2.1 mm，1.7 μm；采用乙腈和0.005 mol/L乙酸銨溶液梯度洗脫，洗脫程0～1 min,20%A;1～4 min,90%A;4～5 min,100%A;5～7 min,20%A。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃ ；進樣量：10 μL離子源：ESI，正離子模式；毛細管電壓：4.0 kV ；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/ hr；錐孔反吹氣流量50 L/ hr；錐孔電壓：40 v；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子對：吡蟲啉，256/175.1(定量離子對)，256/209；阿維菌素，890.5/305.2(定量離子對)，890.5/567.3。

2.5 分析步驟

2.5.1 提取

準(zhǔn)確稱取2.5 g(精確至0.01 g)均勻試樣，用5 mL水將試樣潤濕，放置5 min,加入5 g無水硫酸鈉和15 mL乙腈，渦動3 min，超聲5 min，5000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至濃縮瓶中。用10 mL乙腈再提取一次，合并提取液。將提取液于50 ℃水浴下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干，在殘渣中加入2.0 mL甲醇+二氯甲烷溶液，備用。

2.5.2 凈化

將炭黑氨基柱用4.0 mL甲醇+二氯甲烷溶液(5+95)預(yù)條件化，加入上述待凈化溶液，用10 mL具塞試管收集，用2.0 mL甲醇+二氯甲烷溶液(5+95)洗濃縮瓶后淋洗小柱，重復(fù)一次。將收集溶液置于50 ℃水浴中用氮氣吹干，殘渣用1.0 mL乙腈溶解，在漩渦混合器上混勻，過0.2 μm微孔水相濾膜后于高效液相色譜測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 工作曲線

用流動相將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500ng/mL，以峰面積為縱坐標(biāo)，目標(biāo)化合物的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。阿維菌素和吡蟲啉的相關(guān)系數(shù)分別為R=0．9991和R=0．9985，回歸方程分別為y=2632x+1033和y=8150x+229，在5 ng/mL～500 ng/mL范圍內(nèi)，阿維菌素和吡蟲啉工作曲線線性良好，適合定量分析?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液離子流圖見圖1和圖2。

圖1 吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子流圖

圖2 阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子流圖

3.2 液相色譜、質(zhì)譜測定條件的優(yōu)化

阿維菌素和吡蟲啉的極性較弱，在反相色譜柱上的保留較強，因此選擇較高比例的乙腈作為強洗脫溶劑。母離子掃描顯示：阿維菌素和吡蟲啉在正離子模式下，目標(biāo)物檢測離子以[M+NH4]+形式存在的量較多，在流動相中加入5 mmol/ L乙酸銨可促進母離子的形成。兩種化合物的保留時間、定量離子、定性離子、錐孔電壓及碰撞能量見表1。

表1 各目標(biāo)化合物的檢測離子及質(zhì)譜采集參數(shù)

3.3 凈化條件的選擇

由于茶葉中色素含量較高，所以選取了可以有效吸附色素的色譜柱。結(jié)果表明，炭黑氨基柱可以很好的吸附色素和其他雜質(zhì)，同時，選用合適的洗脫液完全可以將兩種化合物洗脫，從而獲得較高的添加回收率。普通的氨基柱也可獲得較高的添加回收率，但由于不能吸附提取液中的色素，從而增加了對分析柱的污染及對儀器響應(yīng)的干擾，而選用堿性氧化鋁柱和C18 SPE柱時不論選擇哪種淋洗劑，回收率均小于60%。所以最終選用炭黑氨基柱。淋洗液選用甲醇和二氯甲烷，對二者比例進行了優(yōu)化，當(dāng)甲醇和二氯甲烷的比例在1∶99到5∶95之間，回收率均能滿足要求，當(dāng)甲醇和二氯甲烷的比例為5∶95時，回收率達到最大值。

3.4 檢出限

聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)與世界衛(wèi)生組織(WHO)均未制定最高允許殘留限量，加拿大和澳大利亞規(guī)定油菜籽中最高殘留限量為0.05 mg/kg。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織(FAO)所屬的食品中農(nóng)藥殘留立法委員會(CCRPF)規(guī)定了阿維菌素的每日允許攝入量0.1 μg/kg·bw，阿維菌素的最高殘留限量(MRL)為5 μg/kg，美國農(nóng)業(yè)部下屬的食品安全檢驗局(FSIS)規(guī)定的MRL值為20 μg/kg，歐盟規(guī)定MRL值為0.02 mg/kg。加拿大衛(wèi)生部發(fā)布EMRL2012-45號通報，有害生物管理局修訂了吡蟲啉的最大殘留限量。將吡蟲啉在蛋、豬、馬、牛、綿羊、山羊、家禽的脂肪、肉以及肉副產(chǎn)品中的最大殘留限量修訂為0.02×10-6，將吡蟲啉在干黃豆和奶類中的最大殘留限量分別修訂為3.5×10-6和0.03×10-6。本方法的最低檢出限為0.001 mg/kg，完全適合于進出口農(nóng)產(chǎn)品中阿維菌素和吡蟲啉的殘留檢測。

3.5 方法的準(zhǔn)確度與精確度

用上述試驗方法，在樣品中添加不同水平的阿維菌素和吡蟲啉混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進行添加回收率試驗，分別進行了5 μg/kg、20 μg/kg和100 μg/kg三個添加水平的兩種目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收實驗，每個水平重復(fù)測定6次，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。從表2可以看出，平均回收率范圍為81.4%～95.8%，RSD分別為2.0%～8.5%。

3.6 應(yīng)用

該方法已應(yīng)用于茶葉中阿維菌素類藥物殘留的檢測。在對購自湛江市場的5份綠茶、5 份紅茶、5份普洱茶的檢測中,只有其中一份綠茶檢測出10.4μg/kg的吡蟲啉。

4 結(jié)論

本文建立了茶葉中阿維菌素和吡蟲啉的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。通過對提取與凈化方式進行探討與優(yōu)化,在一定程度上減少了茶葉基體對檢測的干擾。采用電噴霧電離源,在含有乙酸銨緩沖液的流動相條件下,以選擇信號強且穩(wěn)定的[M+NH4+]加合離子峰作為母離子,以基質(zhì)校正曲線進行定量。方法穩(wěn)定、可靠、靈敏,能夠滿足國內(nèi)外法規(guī)對茶葉中阿維菌素和吡蟲啉殘留的限量要求,可用于茶葉中阿維菌素和吡蟲啉兩種農(nóng)藥殘留的檢測與確證。

表2 空白茶葉基質(zhì)中2種被測物的添加濃度、添加回收率與精密度(n = 6)

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