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    基于生物量的白靈菇菌株篩選及其深層發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

    2013-10-27 04:09:28趙黎明
    食品科學(xué) 2013年23期
    關(guān)鍵詞:白靈菇響應(yīng)面法正交試驗(yàn)

    冀 宏,趙黎明

    (1.天津大學(xué)管理與經(jīng)濟(jì)學(xué)部,天津 300072;2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,江蘇 常熟 215500)

    摘 要:以深層發(fā)酵菌絲體生物量為考察指標(biāo),對(duì)白靈菇液體深層發(fā)酵的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)正交試驗(yàn)(L9(34))確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方。在此基礎(chǔ)上,基于三因素三水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn),采用響應(yīng)曲面分析法對(duì)影響白靈菇菌絲體生長(zhǎng)的發(fā)酵溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速和發(fā)酵周期進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明:最佳培養(yǎng)基組分為

    (g/100mL):可溶性淀粉3.50、牛肉膏0.40、磷酸二氫鉀0.25、硫酸鎂0.25;當(dāng)搖瓶發(fā)酵溫度為26℃、轉(zhuǎn)速為160r/min,發(fā)酵周期7.5d(180h)時(shí),發(fā)酵菌絲體生物量可達(dá)1.6004g/100mL 。

    關(guān)鍵詞:白靈菇;深層發(fā)酵;生物量;正交試驗(yàn);響應(yīng)面法

    基于生物量的白靈菇菌株篩選及其深層發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

    冀 宏1,2,趙黎明1

    (1.天津大學(xué)管理與經(jīng)濟(jì)學(xué)部,天津 300072;2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,江蘇 常熟 215500)

    摘 要:以深層發(fā)酵菌絲體生物量為考察指標(biāo),對(duì)白靈菇液體深層發(fā)酵的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)正交試驗(yàn)(L9(34))確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方。在此基礎(chǔ)上,基于三因素三水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn),采用響應(yīng)曲面分析法對(duì)影響白靈菇菌絲體生長(zhǎng)的發(fā)酵溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速和發(fā)酵周期進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明:最佳培養(yǎng)基組分為

    (g/100mL):可溶性淀粉3.50、牛肉膏0.40、磷酸二氫鉀0.25、硫酸鎂0.25;當(dāng)搖瓶發(fā)酵溫度為26℃、轉(zhuǎn)速為160r/min,發(fā)酵周期7.5d(180h)時(shí),發(fā)酵菌絲體生物量可達(dá)1.6004g/100mL 。

    關(guān)鍵詞:白靈菇;深層發(fā)酵;生物量;正交試驗(yàn);響應(yīng)面法

    白靈菇(Pleurotus nebrodensis)屬真菌門、擔(dān)子菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬,又名阿魏蘑、阿魏菇、阿魏側(cè)耳等,是國(guó)內(nèi)主要人工栽培食用菌種類之一[1]。目前,白靈菇栽培工藝主要采用固體菌種技術(shù),受到季節(jié)和原材料的限制,且生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高和易污染。實(shí)踐證明[2],通過(guò)食用菌深層液體發(fā)酵工藝制備的液體菌種可替代固體菌種用于栽培生產(chǎn),相對(duì)于固體制種技術(shù),液體菌種具有生產(chǎn)周期短、菌齡一致、發(fā)育點(diǎn)多、菌絲生長(zhǎng)速度快、成本低等優(yōu)勢(shì)[3],因此,對(duì)白靈菇深層液體發(fā)酵技術(shù)的研究展現(xiàn)出誘人的應(yīng)用前景。

    國(guó)外Choi等[4]對(duì)白靈菇液體培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究,當(dāng)溫度為25℃、接種量為5%、初始pH6.5~7.0時(shí)菌絲體生物量可達(dá)1.284g/100mL 。在國(guó)內(nèi),根據(jù)王廣耀[5]、危茂貴[6]、黃聰亮[7]等的研究,以玉米粉、葡萄糖、黃豆粉、蔗糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4為培養(yǎng)基主要成分,得到的發(fā)酵白靈菇菌絲體生物量最高可達(dá)2.75g/100mL 。在發(fā)酵培養(yǎng)條件方面,根據(jù)任海霞[8]、孟俊龍[9]、蘭蓉[10]、胡順珍[11]等的研究,以接種量、裝液量、初始pH值、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間為主要的考察條件,得到的白靈菇菌絲體生物量最高可達(dá)2.16g/100mL 。

    本實(shí)驗(yàn)通過(guò)從來(lái)自國(guó)內(nèi)不同產(chǎn)區(qū)的19個(gè)白靈菇生產(chǎn)菌種中篩選出生長(zhǎng)速度快,品質(zhì)好的菌株(河北武安天山2號(hào))為出發(fā)菌株,以白靈菇發(fā)酵菌絲體干質(zhì)量為測(cè)定指標(biāo),采用正交試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,旨在縮短發(fā)酵周期、提高菌絲體生物量,為深層發(fā)酵制備白靈菇液體菌種技術(shù)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 菌種與培養(yǎng)基

    1.1.1 白靈菇菌種

    分別自相關(guān)高校、科研院所及合法食用菌生產(chǎn)銷售機(jī)構(gòu)獲得國(guó)內(nèi)不同產(chǎn)區(qū)的19個(gè)白靈菇菌種(表1)。并采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA ITS)序列多態(tài)性分析技術(shù)對(duì)上述菌種進(jìn)行了遺傳學(xué)鑒定(相關(guān)研究?jī)?nèi)容另文報(bào)道)。以上各菌株經(jīng)PDA培養(yǎng)基活化,保藏。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    優(yōu)勢(shì)菌株篩選培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200、葡萄糖20、瓊脂20,pH值自然。

    一級(jí)搖瓶培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20、胰蛋白胨4、磷酸二氫鉀3、硫酸鎂1.5、VB10.02,pH值自然。

    碳源供試培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨4.0、磷酸二氫鉀3.0、硫酸鎂1.5、碳源20(葡萄糖、麥芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉),pH值自然。

    氮源供試培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20、磷酸二氫鉀3.0、硫酸鎂1.5、氮源4.0(牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀),pH值自然。

    1.2 儀器與設(shè)備

    ZQLY-180型振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司;CH1200893型分析天平 伯拉莫貝林精密儀器有限公司;CJ-1S型超凈工作臺(tái)、WGL-45B電熱鼓風(fēng)干燥箱天津市泰斯特儀器有限公司;PQX-280A-22HM人工氣候箱 寧波萊??萍加邢薰?;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

    1.3 方法

    1.3.1 菌絲體生物量測(cè)定

    菌絲體生物量的測(cè)定采用菌絲體干質(zhì)量法,將發(fā)酵醪液過(guò)80目不銹鋼標(biāo)準(zhǔn)篩,用蒸餾水沖洗3次,將過(guò)濾所得的菌絲體于60℃數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒質(zhì)量,用分析天平稱質(zhì)量,得菌絲體干質(zhì)量[12]。

    1.3.2 優(yōu)勢(shì)菌株篩選

    在同等條件下,將不同產(chǎn)區(qū)白靈菇菌種分別接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)中,重復(fù)3次。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察并記錄菌絲萌發(fā)情況。待菌絲在培養(yǎng)基表面開始生長(zhǎng),用十字交叉法測(cè)定菌落直徑,每隔24h測(cè)量1次,連續(xù)測(cè)量5次,計(jì)算菌絲體日均生長(zhǎng)速率;同時(shí)觀察記載菌絲長(zhǎng)勢(shì):菌絲粗細(xì)、濃密程度及色澤等[13]。選擇菌絲體日均生長(zhǎng)速率最快,長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株作為供試菌株。菌絲體日均生長(zhǎng)速率利用如下公式計(jì)算。

    1.3.3 一級(jí)搖瓶菌種的制備

    配制一級(jí)搖瓶培養(yǎng)基,將配好的培養(yǎng)基分裝入250mL的搖瓶中,每瓶分裝100mL,于121℃滅菌20min,冷卻備用。取白靈菇優(yōu)勢(shì)菌株,無(wú)菌操作接種0.5cm×0.5cm的菌種塊(10日菌齡)于搖瓶?jī)?nèi),注意盡量使菌塊漂浮在液面上。每瓶接種3塊。26℃靜置培養(yǎng)24h,然后置于26℃恒溫振蕩培養(yǎng),搖床轉(zhuǎn)速180r/min,培養(yǎng)時(shí)間12d。

    1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源和氮源篩選實(shí)驗(yàn)

    1.3.4.1 不同碳源對(duì)產(chǎn)菌絲體的影響

    將配制好的1.1.2節(jié)碳源供試培養(yǎng)基分裝入250mL的搖瓶中,每瓶分裝100mL,于121℃滅菌20min,冷卻之后在無(wú)菌條件下將預(yù)先制備的白靈菇一級(jí)搖瓶菌絲體接種到培養(yǎng)基中,接種量為10%,置于26℃,180r/min的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)6d。每組設(shè)置3個(gè)平行。并對(duì)篩選出的最佳碳源進(jìn)行單因素試驗(yàn),以確定最佳水平范圍。

    1.3.4.2 不同氮源對(duì)產(chǎn)菌絲體的影響

    配制1.1.2節(jié)氮源供試培養(yǎng)基,方法同1.3.4.1節(jié)。并對(duì)篩選出的最佳氮源進(jìn)行單因素試驗(yàn),以確定最佳水平范圍。

    1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)

    基于最佳碳、氮源篩選結(jié)果,進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)(L9(34))設(shè)計(jì),對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化。發(fā)酵條件:26℃、搖瓶轉(zhuǎn)速180r/min、培養(yǎng)液裝量100mL/250mL 三角瓶、接種量為10%、pH值自然、發(fā)酵時(shí)間6d,以菌絲體生物量為考察指標(biāo),每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行。因素及水平設(shè)計(jì)見表2。

    1.3.6 發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

    選用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基,分別考察發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵周期對(duì)白靈菇產(chǎn)菌絲體的影響,確定各影響因子的最佳范圍。

    艾迪僅在屬于她的唯一一篇內(nèi)心獨(dú)白中發(fā)聲,其內(nèi)心獨(dú)白被福克納濃縮至寥寥數(shù)語(yǔ),卻又如此豐富。《在我彌留之際》更以艾迪·本德倫的視角為核心,在艾迪的視角下,她對(duì)這場(chǎng)葬禮的感知是:對(duì)丈夫安斯的復(fù)仇。她在內(nèi)心獨(dú)白中如是說(shuō):“而我的報(bào)復(fù)將是他永遠(yuǎn)也不知道我在報(bào)仇。達(dá)爾出生后我要求安斯做出許諾,等我死后把我運(yùn)回杰弗遜去安葬?!保?]

    1.3.6.1 發(fā)酵溫度的影響

    分別設(shè)定發(fā)酵溫度24、25、26、27、28℃5個(gè)水平。分別在接種量10%、搖床轉(zhuǎn)速180r/min條件下發(fā)酵6d,測(cè)定菌絲體生物量,每個(gè)水平試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

    1.3.6.2 搖床轉(zhuǎn)速的影響

    在發(fā)酵溫度26℃條件下,設(shè)定搖床轉(zhuǎn)速為120、140、160、180、200r/min分別考察對(duì)發(fā)酵產(chǎn)菌絲體的影響。其他條件及方法同1.3.6.1節(jié)。

    1.3.6.3 發(fā)酵時(shí)間的影響

    設(shè)定發(fā)酵24h后每隔24h測(cè)定發(fā)酵菌絲體生物量和發(fā)酵液pH值,共測(cè)定9d,考察不同發(fā)酵周期對(duì)產(chǎn)菌絲體的影響。培養(yǎng)溫度26℃、搖床轉(zhuǎn)速180r/min,其他條件及方法同1.3.6.1節(jié)。

    1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    采用響應(yīng)面法(RSM)中Box-Behnken模型對(duì)影響白靈菇深層發(fā)酵菌絲體生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化。數(shù)據(jù)處理軟件為SAS軟件。

    參照文獻(xiàn)[14-20]進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn),按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求,根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,利用響應(yīng)面分析法(RSM)設(shè)溫度、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵周期為自變量,分別為X1、X2、X3;每一自變量的低、中、高水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼,以菌絲體生物量為因變量,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每次3個(gè)平行,如表3所示。

    2 結(jié)果與分析

    白靈菇菌絲體發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌株篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。以菌絲體日均生長(zhǎng)速率為指標(biāo),14號(hào)菌株(河北武安天山2號(hào))的菌絲體日均生長(zhǎng)速率要高于其他18種白靈菇菌株,其菌絲體日均生長(zhǎng)速率達(dá)0.48cm/d。通過(guò)平板培養(yǎng)過(guò)程的觀察,河北武安天山2號(hào)菌株的生長(zhǎng)速率較快,長(zhǎng)勢(shì)較好且菌絲粗壯,這也有利于工業(yè)生產(chǎn)上縮短發(fā)酵周期,因此選擇河北武安天山2號(hào)作為進(jìn)一步研究的菌株。

    2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源和氮源篩選

    2.2.1 碳源篩選結(jié)果

    碳源是細(xì)胞 結(jié)構(gòu)的重要組成成分,又是菌體產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物和細(xì)胞內(nèi)貯藏物質(zhì)的主要原料[21]。因此,選出適宜的碳源對(duì)其深層發(fā)酵至關(guān)重要。

    由圖2可知,最佳碳源為可溶性淀粉,生物量為0.577g/100mL 。其次為果糖。乳糖對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最小,生物量?jī)H為0.318g/100mL 。由數(shù)據(jù)可知白靈菇對(duì)多糖的利用明顯好于單糖和二糖。這是因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的糖一般能被菌體快速利用,但過(guò)多會(huì)過(guò)分加速呼吸,使溶氧不能滿足需要,并使一些中間產(chǎn)物不能完全氧化而積累,影響某些酶的活性,從而抑制菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。對(duì)白靈菇這樣的真菌培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng),如只將單糖或二糖作為碳源,必然導(dǎo)致菌體中后期生長(zhǎng)受抑制;而多糖則需經(jīng)菌體產(chǎn)生的胞外酶水解成單糖后再被吸收利用,克服了單糖、二糖代謝過(guò)快的缺點(diǎn)[22]。

    2.2.2 氮源篩選結(jié)果

    由圖3可知,最佳氮源為牛肉膏,生物量達(dá)到0.317g/100mL ;其次為胰蛋白胨;酵母膏對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最小,生物量?jī)H為0.035g/100mL 。白靈菇在無(wú)機(jī)氮中生長(zhǎng)緩慢,這是因?yàn)闊o(wú)機(jī)氮源不能提供白靈菇自身不能合成而生長(zhǎng)發(fā)育所必需的一些氨基酸[23]。

    2.3 最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽單因素試驗(yàn)

    2.3.1 碳源質(zhì)量濃度對(duì)白靈菇菌絲體深層發(fā)酵的影響

    由圖4可知,當(dāng)可溶性淀粉質(zhì)量濃度達(dá)到3.0g/100mL時(shí)菌絲體產(chǎn)量達(dá)到最高,生物量為0.746g/100mL ,其質(zhì)量濃度過(guò)高和過(guò)低都不利于白靈菇菌絲體產(chǎn)量的提高,故可溶性淀粉質(zhì)量濃度在2.5~3.5g/100mL為宜。

    2.3.2 氮源質(zhì)量濃度對(duì)白靈菇菌絲體深層發(fā)酵的影響

    由圖5可知,當(dāng)牛肉膏質(zhì)量濃度達(dá)到0.50g/100mL 時(shí)菌絲體產(chǎn)量達(dá)到最高,生物量為0.539g/mL,其質(zhì)量濃度過(guò)高和過(guò)低都不利于白靈菇菌絲體產(chǎn)量的提高,故牛肉膏質(zhì)量濃度在4~6g/L為宜。

    2.3.3 無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量濃度對(duì)白靈菇菌絲體深層發(fā)酵的影響

    由圖6可知,當(dāng)磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度達(dá)到0.20g/100mL 時(shí)菌絲體產(chǎn)量達(dá)到最高,為0.621g/100mL ,其質(zhì)量濃度過(guò)高和過(guò)低都不利于白靈菇菌絲體產(chǎn)量的提高,故磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度在0.15~0.25g/100mL 為宜。

    2.3.4 硫酸鎂質(zhì)量濃度對(duì)白靈菇菌絲體深層發(fā)酵的影響

    由圖7可知,當(dāng)硫酸鎂質(zhì)量濃度達(dá)到0.25g/100mL 時(shí)菌絲體產(chǎn)量達(dá)到最高,生物量為0.339g/100mL ,其質(zhì)量濃度過(guò)高和過(guò)低都不利于白靈菇菌絲體產(chǎn)量的提高,故硫酸鎂質(zhì)量濃度在0.2~0.3g/100mL為宜。

    2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)優(yōu)化

    采用可溶性淀粉為碳源,牛肉膏為氮源,磷酸二氫鉀、硫酸鎂為無(wú)機(jī)鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基,進(jìn)行1.3.5節(jié)正交試驗(yàn)(L9(34)),測(cè)定菌絲體干質(zhì)量,結(jié)果和數(shù)據(jù)分析見表4和圖8。由表4直觀反映,第7號(hào)實(shí)驗(yàn)組合條件A3B1C3D2的菌絲體生物量最大(0.666g/100mL ),是各實(shí)驗(yàn)組中效果最好的;k值與極差分析顯示,影響菌絲體發(fā)酵的因素主次順序?yàn)椋篈(可溶性淀粉)>D(硫酸鎂)>C(磷酸二氫鉀)>B(牛肉膏)。理論最優(yōu)條件組合為A3B1C3D2,即發(fā)酵培養(yǎng)基中可溶性淀粉、牛肉膏、磷酸二氫鉀和硫酸鎂質(zhì)量濃度分別為3.50、0.40、0.25、0.25g/100mL 時(shí),發(fā)酵白靈菇生物量最高。而由表4磷酸二氫鉀k值可知,k1和k3數(shù)值基本相等,則磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度可選取水平1(0.15g/100mL)和水平3(0.25g/100mL),對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明,在相同工藝條件下采用發(fā)酵培養(yǎng)基組合A3B1C3D2得發(fā)酵菌絲體干質(zhì)量0.632g/100mL ,高于A3B1C1D2條件下菌絲體干質(zhì)量0.542g/100mL ,故發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方案確定為A3B1C3D2。

    2.5 發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

    圖9表明,溫度從24℃上升到26℃的過(guò)程中,菌絲體生物量逐漸升高,增加趨勢(shì)較明顯,可能是由于隨著溫度升高與白靈菇菌絲體細(xì)胞生長(zhǎng)代謝相關(guān)的酶活性逐漸增加所致。隨著培養(yǎng)溫度升至26~28℃,菌絲體生物量明顯下降,原因一方面可能是與白靈菇菌絲體細(xì)胞生長(zhǎng)代謝相關(guān)的酶耐熱性差,隨培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高,酶活生物量,甚至變性失活;另一方面可能是由于白靈菇屬于低溫型食用菌,菌種在高溫時(shí)大部分已死亡,無(wú)法繼續(xù)生長(zhǎng)。綜合以上分析確定白靈菇發(fā)酵溫度為26℃。

    搖床轉(zhuǎn)速直接影響搖瓶通氣量的大小。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速過(guò)低時(shí),通氣量小,培養(yǎng)基內(nèi)溶氧不足,難以滿足菌絲體對(duì)氧氣的需求;轉(zhuǎn)速過(guò)高則剪切作用增強(qiáng),增大了對(duì)菌球的機(jī)械刺激,亦不利于菌絲體的生長(zhǎng)[24-25]。圖10表明,在搖床轉(zhuǎn)速160r/min時(shí),菌絲體生物量最高,轉(zhuǎn)速過(guò)高或過(guò)低均不利于白靈菇菌絲體的生長(zhǎng)。

    由圖11可知,從發(fā)酵開始至6d左右,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),菌絲體生物量呈快速上升趨勢(shì),發(fā)酵液的pH值則呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì);6d之后菌絲體生物量呈緩慢上升直至基本穩(wěn)定,同時(shí),發(fā)酵液pH值下降趨勢(shì)趨緩至基本穩(wěn)定。6d后白靈菇菌絲體增長(zhǎng)緩慢可能有兩方面的原因:一是再培養(yǎng)過(guò)程中菌絲球直徑增大,導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和溶解氧向內(nèi)傳遞越來(lái)越困難,使得菌絲體增加越來(lái)越困難,進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期;二是隨著發(fā)酵的進(jìn)行,培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分被不斷消耗,代謝產(chǎn)物不斷積累,使得菌絲體吸收不到足夠的營(yíng)養(yǎng),生長(zhǎng)緩慢。pH值下降可能是因?yàn)榘嘴`菇菌絲體在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生酸性物質(zhì),隨著時(shí)間的推移,酸性物質(zhì)不斷積累,導(dǎo)致培養(yǎng)液內(nèi)pH值不斷下降,最后由于菌絲體受到養(yǎng)分不足和代謝產(chǎn)物等的影響,生長(zhǎng)緩慢并趨于穩(wěn)定,因此,發(fā)酵液內(nèi)的pH值也隨之趨于穩(wěn)定。綜合考慮發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)必將增加生產(chǎn)成本等因素,故將白靈菇菌絲體液體發(fā)酵時(shí)間設(shè)定在7d。

    2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與優(yōu)化分析

    2.6.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

    根據(jù)單因素試驗(yàn)所確定的水平,采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)白靈菇菌絲體發(fā)酵條件進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)(表3),包括12個(gè)析因?qū)嶒?yàn)和3個(gè)中心實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表5所示?;貧w方程的方差分析結(jié)果歸納見表6。

    由表6回歸方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果表明,X2、X3、X1

    2、X1X2、X22、X3

    2項(xiàng)影響是極為顯著(P<0.01);由此所建立的模型也是極為顯著(P<0.01);X1、X1X3對(duì)白靈菇發(fā)酵產(chǎn)菌絲體生物量的影響為顯著(P<0.05);X2X3對(duì)白靈菇發(fā)酵產(chǎn)菌絲體生物量的影響不顯著(P>0.05)。因此各具體實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,而是呈二次拋物面關(guān)系。復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.9936,說(shuō)明由這3個(gè)因素及其二次項(xiàng)所建立的模型能解釋白靈菇發(fā)酵產(chǎn)菌絲體生物量變化的99.36%,因此回歸方程給白靈菇發(fā)酵產(chǎn)菌絲體提供了一個(gè)合適的模型。

    由表6可知,各因素影響程度主次順序?yàn)椋篨3(發(fā)酵周期)>X2(搖床轉(zhuǎn)速)>X1(發(fā)酵溫度)。由上述結(jié)果得出溫度(X1)、搖床轉(zhuǎn)速(X2)、發(fā)酵周期(X3)與菌絲體生物量(Y)的二次多項(xiàng)回歸方程(編碼后)為:Y=1.559767-0.045088 X1+0.066713 X2+0.1822 X3-0.131421 X12-0.091925 X1X2+0.0634 X1X3-0.358571 X22+0.04395 X2X3-0.153246 X32。

    圖12為運(yùn)用SAS軟件分析得到的響應(yīng)面圖,從圖中可以直觀地看出,各因子對(duì)響應(yīng)值的影響變化趨勢(shì),而且回歸模型存在最大值,即白靈菇菌絲體生物量在各因素所選擇的范圍內(nèi)存在極值,即響應(yīng)面的最高點(diǎn)。

    為了求出最佳點(diǎn)的編碼值,對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)并整理得最佳發(fā)酵條件為溫度(X1)=25.89℃,搖床轉(zhuǎn)速(X2)=163r/min,發(fā)酵周期(X3)=7.48d(即179.52h),此時(shí)白靈菇菌絲體生物量最大估計(jì)值Y=1.632g/100mL ??紤]到實(shí)際操作的便利,確定發(fā)酵條件的最佳組合為:溫度26℃,搖床轉(zhuǎn)速160r/min,發(fā)酵周期7.5d(即180h)。

    2.6.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

    為檢驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性,用以上得到的最佳組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),重復(fù)5次。得到的白靈菇菌絲體生物量為1.6004g/100mL ,與預(yù)測(cè)值Y=1.632g/100mL 擬合較好,說(shuō)明回歸方程為白靈菇菌絲體發(fā)酵提供了一個(gè)合適的模型。

    3 結(jié) 論

    實(shí)驗(yàn)從來(lái)自中國(guó)不同產(chǎn)區(qū)的19株白靈菇生產(chǎn)菌種中篩選出河北武安天山2號(hào),該菌株生長(zhǎng)速率快,品質(zhì)好。

    以河北武安天山2號(hào)菌株為實(shí)驗(yàn)菌株,通過(guò)正交設(shè)計(jì)及響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)?zāi)軌驅(qū)崿F(xiàn)白靈菇菌絲體深層發(fā)酵工藝的優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分為可溶性淀粉3.50g/100mL 、牛肉膏0.40g/100mL 、磷酸二氫鉀0.25g/100mL 、硫酸鎂0.25g/100mL ,pH值自然;優(yōu)化發(fā)酵條件為溫度26℃、搖床轉(zhuǎn)速160r/min、發(fā)酵周期7.5d(180h)。此條件下發(fā)酵菌絲體生物量可達(dá)到1.6004g/100mL,實(shí)際值較預(yù)測(cè)值小1.94%,達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

    本實(shí)驗(yàn)為白靈菇菌絲體深層發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用和工藝優(yōu)化研究提供了依據(jù)、方法和途徑。與已有的其他研究結(jié)果相比,本研究簡(jiǎn)化了白靈菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分,縮短了培養(yǎng)周期,降低了液體發(fā)酵的生產(chǎn)成本,對(duì)于生產(chǎn)實(shí)際具有較好參考價(jià)值。

    [1] 官志遠(yuǎn), 任海霞, 李瑾, 等. 白靈菇菌絲生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)優(yōu)化試驗(yàn)[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008(7): 74-76; 79.

    [2] 李玉梅, 陳艷秋. 黑木耳液體菌種應(yīng)用于生產(chǎn)應(yīng)注意的幾個(gè)問題[J].食用菌, 2006(5): 34-35.

    [3] 李書倩. 白靈菇深層發(fā)酵和多糖提取工藝的研究[D]. 沈陽(yáng): 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

    [4] CHOI D B, NAM H G, CHA W S. Studies on cultivation and biological activities of Pleurotus nebrodensis inzenga[J]. Korean Journal of Chemical Engineering, 2006, 23(2): 241-246.

    [5] 王廣耀. 白靈菇液體菌種培養(yǎng)及栽培技術(shù)研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2007.

    [6] 危茂貴, 鐘衛(wèi)民, 歐陽(yáng)建華. 白靈菇液體菌種培養(yǎng)條件及栽培試驗(yàn)[J]. 食用菌學(xué)報(bào), 2005, 12(2): 47-52.

    [7] 黃聰亮, 唐玉琴. 白靈菇液體培養(yǎng)工藝研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(35): 11382-11383.

    [8] 任海霞, 官志遠(yuǎn), 曲玲, 等. 白靈菇液體培養(yǎng)工藝的初步研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2009, 25(4): 183-186.

    [9] 孟俊龍, 閏輝, 楊杰, 等. 白靈菇深層發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 30(6): 548-552.

    [10] 蘭蓉, 張震, 吳迪, 等. 白靈菇多糖液體發(fā)酵工藝的優(yōu)化[J]. 中國(guó)食用菌, 2010, 29(2): 42-44.

    [11] 胡順珍, 許梅, 賈樂. 白靈菇產(chǎn)胞外多糖液體培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技, 2007, 28(7): 76-78; 81.

    [12] 宋瑞清, 向儒江, 翟傳葉. 高效降解石油外生菌根真菌的室內(nèi)篩選[J]. 菌物研究, 2010, 8(2): 96-102.

    [13] 張長(zhǎng)青, 王紅英, 張建民, 等. 適宜白靈菇菌絲生長(zhǎng)條件的研究[J].特產(chǎn)研究, 2003(4): 12-14; 18.

    [14] 歐宏宇, 賈士儒. SAS軟件在微生物培養(yǎng)條件優(yōu)化中的應(yīng)用[J]. 天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào), 2001(1): 14-16; 27.

    [15] 牛廣財(cái), 朱丹, 李志江, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化桑黃菌產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)條件研究[J]. 中國(guó)釀造, 2009(2): 68-71.

    [16] 張智, 朱宏亮, 鈕宏禹, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵條件[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(12): 400-404.

    [17] 王永斌, 王允祥. 翹鱗傘胞外多糖液體培養(yǎng)條件響應(yīng)曲面法優(yōu)化研究[J]. 試驗(yàn)報(bào)告與理論研究, 2008, 11(11): 22-26.

    [18] MONTGOMERY D C. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析[M]. 汪仁官, 陳榮, 譯. 北京: 中國(guó)統(tǒng)計(jì)出版社, 1998: 373.

    [19] 郝學(xué)財(cái), 余曉斌, 劉志鈺, 等. 響應(yīng)面方法在優(yōu)化微生物培養(yǎng)基中的應(yīng)用[J]. 食品研究與開發(fā), 2006, 27(1): 38-41.

    [20] THOMPSON D R. Response surface experimentation[J]. Journal of Food Processing and Preservation, 1982(6): 155.

    [21] 李正鵬, 林毅, 蔡永萍, 等. 白靈菇液體發(fā)酵工藝[J]. 生物學(xué)雜志, 2006, 23(1): 28-30.

    [22] 劉曉鵬, 姜寧, 魏璐, 等. 白靈菇深層發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究[J]. 中國(guó)釀造, 2009(3): 65-68.

    [23] 丁玉萍. 以豆渣為原料培養(yǎng)白靈菇菌絲體的研究[J]. 中國(guó)食用菌, 2008, 27(2): 43-45.

    [24] 李正鵬. 白靈菇液體發(fā)酵及其胞外多糖生物活性的研究[D]. 合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

    [25] 貟建民,李赟,高靜. 中藥大黃對(duì)白靈菇液態(tài)發(fā)酵多糖含量的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 34(10): 116-119.

    Strain Screening of Pleurotus nebrodensis and Optimization of Submerged Culture Conditions for Biomass P rodution

    JI Hong1,2, ZHAO Li-ming1
    (1. Department of Management and Economics, Tianjin University, Tianjin 300072, China;2. School of Biology and Food Engineering, Changshu Insti tute of Technology, Changshu 215500, China)

    Pleurotus nebrodensis Tianshan No.2 from Wuan, Hebei province was selected as the fa stest-growing of 19 strains. The culture medium for submerged fermentation of st rain Tianshan No.2 were optimized for the maximum biomass (dry cell weight, DCW) production using an orthogonal a rray design L9(34), and th ree culture conditions including temperature, shaking speed and time were optimized by response surface analysis based on a three-variable, three-level Box-Behnken experimental design. The results showed that the optima l medium composition (per 100 mL) was 3.50 g of soluble starch, 0.40 g of beef extract, 0.25 g of monopotassium phospha te and 0.25 g of magnesium sulfate. The mycelia biomass of strain Tianshan No.2 was 1.6004 g /100 mL after 7.5 d (180 h) of shaking culture at 26 ℃ with a shaking speed of 160 r/min using the optimized medium.

    Pleurotus nebrodensis;submerged fermentation ;mycelia biomass ;orthogonal array design;response surface methodology

    Q815

    A

    1002-6630(2013)23-0221-07

    10.7506/spkx1002-6630-201323046

    2013-06-22

    蘇州市科技局應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(SYN201007)

    冀宏(1969—),男,教授,博士,研究方向?yàn)榧夹g(shù)經(jīng)濟(jì)及管理、食用菌工程技術(shù)。E-mail:jihong@cslg. cn

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