多種抗生素抗性基因在兒童腸道菌群的攜帶狀況

文 雯，徐先林，歐剛衛(wèi)

(遵義醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

多種抗生素抗性基因在兒童腸道菌群的攜帶狀況

文 雯，徐先林，歐剛衛(wèi)

(遵義醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

目的了解兒童腸道菌群中多種抗生素抗性基因的攜帶情況。方法采集3～5歲兒童糞便標本，分別為3月內(nèi)未使用抗生素標本8例和1～3周內(nèi)使用過頭孢類抗生素標本8例。提取糞便細菌總DNA，PCR分析抗生素抗性基因。結(jié)果在兩組各7例樣本中檢出四環(huán)素抗性基因tetB，兩組全部樣本中均檢出大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗性基因ermB，1～3周內(nèi)使用過頭孢類抗生素兒童中β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因blaTEM檢出數(shù)高于對照組。結(jié)論兒童腸道菌群中普遍存在四環(huán)素抗性基因tetB和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗性基因ermB，短期使用頭孢類抗生素兒童糞便中攜帶β-內(nèi)酰胺酶類抗生素抗性基因blaTEM數(shù)較3月內(nèi)未使用抗生素兒童數(shù)多。

腸道菌群；抗生素抗性基因；兒童

抗生素廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)療和畜牧、水產(chǎn)業(yè)中，對疾病防治或促進動物的生長發(fā)育有著十分重要的作用。長期以來，大量和不規(guī)范地使用抗生素，對環(huán)境和人類健康已經(jīng)構(gòu)成巨大的潛在威脅。環(huán)境的篩選壓力使細菌耐藥菌株在數(shù)量、多樣性以及抗性強度上都顯著增加[1]?？股乜剐曰?Antibiotic Resistant Genes，ARGs)隨細菌在環(huán)境中傳播、擴散, 對公共衛(wèi)生構(gòu)成威脅。

我們采用PCR方法，探討遵義市3～5歲兒童腸道菌群中多種ARGs的攜帶情況及短期使用頭孢類抗生素對β-內(nèi)酰胺酶類抗生素抗性基因的影響。

1 資料與方法

1.1 標本采集、分組 在遵義市幼兒園采集3～5歲健康兒童糞便樣本，3個月內(nèi)無抗生素使用史樣本8例(對照組)其中男孩4例，女孩4例；1～3周內(nèi)有頭孢類抗生素使用史樣本8例(抗生素組)其中男孩5例，女孩3例。對照組兒童平均年齡為4.75歲，抗生組兒童平均年齡為4.11歲(見表1)。標本采集后，在4 ℃條件下送至實驗室，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1樣本兒童的年齡分布(n=8)

組別年齡平均值標準差范圍(最大值、最小值)對照組 4.74.7±0.365.1,3.8抗生素組4.14.1±1.105.2,2.5

1.2 樣本細菌DNA提取 糞便基因組DNA快速提取試劑盒說明書(天根生化科技有限公司，北京)提取樣本DNA。取180～220 mg糞便樣本至2 ml離心管中，加入緩沖液GSL高溫裂解，再逐步加入抑制吸附片lnhibitEX、蛋白酶K和無水乙醇反復(fù)多次離心后，將所得溶液加入到吸附柱CR2中，離心后加入緩沖液TB，收集所得液體。將提純的DNA進行純度和濃度測定，濃度在50 ng/μL以上，OD260/OD280在1.8～2.0的DNA樣品可直接用于后續(xù)實驗。部分標本DNA純度較差的進行DNA純化處理后再行后續(xù)試驗。

1.3 抗生素抗性基因擴增 四環(huán)素類抗生素抗性基因tetB上游引物：TACGTGAATTTATTGCTTCGG，下游引物：ATACAGCATCCAAAGCGCAC[2]。大環(huán)內(nèi)脂類ermB基因上游引物：CTATCTGATTGTTGAAGAAGGATT，下游引物：GTTTACTCTTGGTTTAGGATGAAA[3]。β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因TEM上游引物:KACAATAACCCTGRTAAATGC，下游引物: AGTATATATGAGTAAACTTGG。R, wobble (A + G), K，wobble (G + T)[4]。采用PCR Master Mix K 1081試劑盒(Fermentas公司，上海)進行PCR擴增，反應(yīng)體系為上游引物(10 pmol/μl)2 μL，下游引物(10 pmol/μL)2 μL，DNA100 ng，PCR Master Mix(2×) 25 μL，用去離子水補充體積至50 μL。PCR擴增條件：大環(huán)內(nèi)酯類ermB基因：95 ℃ 3 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃45 s共35個循環(huán)；延伸72 ℃7 min。四環(huán)素類tetB基因：94 ℃5 s；61 ℃30 s，72 ℃30 s共25個循環(huán)，取產(chǎn)物2 μL后，按照上述體系加入PCR Master Mix(2×)和去離子水，94 ℃5 s；61 ℃30 s，72 ℃30 s共25個循環(huán)，延伸72 ℃7 min。將擴增后的反應(yīng)產(chǎn)物取4.5 μL經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.4 PCR產(chǎn)物測序 將PCR擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(上海生工，上海)測序，用BLAST(the Basic Local Alignment Search Tool)在GenBank進行比較分析。序列比較相似性≥97%的為同一基因。

2 結(jié)果

2.1 四環(huán)素類抗生素抗性基因檢測 四環(huán)素類抗生素抗性基因tetB PCR 結(jié)果顯示，兩組樣本中分別在7個樣本中檢測到tetB。DNA序列測定結(jié)果證實擴增條帶為tetB基因(見圖1)。

2.2 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗性基因檢測 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗性基因ermB PCR 結(jié)果顯示，兩組樣本中所有樣本均檢測到ermB基因。DNA序列測定結(jié)果證實擴增條帶為tetB基因(見圖2)。

2.3 β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因檢測 β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因blaTEM在對照組8例標本中僅在4號標本檢測出目標基因，1～3周內(nèi)使用過頭孢類抗生素兒童中有3例標本檢測出目標基因(見圖3)。

3 討論

在人體消化道，腸道自身環(huán)境及細菌性質(zhì)等因素決定了腸道菌群的組成?？股氐膹V泛使用導(dǎo)致的環(huán)境選擇壓力，耐藥菌株的數(shù)量、多樣性以及抗性強度都顯著增加[1]。人們不僅關(guān)注抗生素對環(huán)境的影響, 更將抗生素抗性基因的傳播以及對人體健康的影響作為關(guān)注的焦點，相關(guān)的研究報道迅速增加[ 5-8 ]?，F(xiàn)今在飲用水、空氣、河流、土壤等環(huán)境介質(zhì)中已發(fā)現(xiàn)多種抗性基因如β-內(nèi)酰胺類抗性基因、四環(huán)素類抗性基因、磺胺類抗性基因等[5]。環(huán)境中細菌組成及耐藥菌株，對定植腸道的菌群組成及菌群中攜帶耐藥基因的細菌數(shù)量和種類以及由此對宿主的影響尚待研究。已有研究表明，長期或短期使用抗生素可導(dǎo)致腸道共生菌群組成的變化[9-10]，而腸道微生態(tài)的改變對宿主產(chǎn)生多方面的影響，包括免疫系統(tǒng)發(fā)育[11]、抗感染及多種代謝性疾病[12]。腸道菌群中耐藥基因的種類及耐藥基因在腸道菌群中不同細菌之間的傳播，可能導(dǎo)致多種耐藥菌株的產(chǎn)生。Sapkota等[13]在大型養(yǎng)豬場室內(nèi)空氣中發(fā)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)脂抗生素抗性基因ermB等多類抗性基因。胡建英等[5]在中國溫榆河流域中檢測到tetB等多種四環(huán)素類抗性基因。目前國內(nèi)外報道最多的是抗生素抗性基因在環(huán)境中的分布狀況，而在人體內(nèi)的分布狀況及其傳播途徑仍不清楚。我們分析了遵義市幼兒園3～5歲健康兒童腸道菌群耐藥基因攜帶情況，結(jié)果顯示，雖然受試兒童并沒有明確使用四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)脂類抗生素的歷史，而在幾乎所有樣本中，檢出四環(huán)素類抗生素抗性基因tetB以及大環(huán)內(nèi)脂類抗性基因ermB基因。說明四環(huán)素類抗生素抗性基因tetB及大環(huán)內(nèi)脂類抗性基因ermB基因不僅存在于環(huán)境中，在人腸道菌群中也同樣存在。而短期內(nèi)使用頭孢類抗生素兒童，腸道菌群中耐β-內(nèi)酰胺酶類抗生素抗性基因blaTEM多于未使用頭孢類抗生素組。四環(huán)素類抗生素曾廣泛應(yīng)用于臨床，由于常見病原菌對本類藥物耐藥性普遍升高及其不良反應(yīng)多見，目前本類藥物臨床應(yīng)用已受到很大限制，尤其是在兒童中幾乎不再使用，但在畜牧、水產(chǎn)等領(lǐng)域仍廣泛使用。由結(jié)果表明，在兒童腸道菌群建立過程中，某些環(huán)境中攜帶有耐藥基因的細菌定植于腸道，短期使用某些抗生素如頭孢類抗生素，會導(dǎo)致腸道菌群中攜帶有β-內(nèi)酰胺酶類抗生素抗性基因blaTEM明顯。

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[收稿2012-12-21;修回2013-02-27]

(編輯：譚秀榮)

Studyonthecarryingstatusofantibioticresistancegenesinchildrenintestinalflora

Wenwen,Xuxianlin,Ougangwei

(Department of Biochemistry, Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563099, China)

ObjectiveTo investigate the carrying status of antibiotic resistance genes in children intestinal flora.MethodsSixteen feacal samples from 3 to 5 year-old children in Zunyi were collected in this study including 8 cases without any antibiotic treatment in three months as control group and 8 cases receiving cephalosporins treatment within 1 to 3 weeks as treatment group. The antibiotic resistant genes in feacal samples were analyzed by PCR after DNA extraction.ResultsThe macrolide antibiotics resistance gene ermB was detected in all samples and the tetracycline resistance gene tetB was showed in 7 cases of each group. The detection rate of β-lactam antibiotic resistance gene blaTEMin treatment group was higher than that in control group.ConclusionermB and tetB are widely distributed in children intestinal flora. The administration of antibiotics such as cephalosporins could aggravate the emerging antibiotic resistant genes in children intestinal flora.

intestinal flora; antibiotic resistance genes; children

R372

A

1000-2715(2013)02-0113-03

貴州省科技廳基金項目(NO:C-487);遵義醫(yī)學(xué)院博士啟動基金項目(NO:F-391)。

歐剛衛(wèi)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：腸道免疫和腸道菌群，E-mail:gangwei.ou@zmc.edu.cn。