α-淀粉酶AmyP對有機(jī)溶劑和表面活性劑的耐受性

劉源濤，汪 穎，鄭昀昀，彭 惠

(安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院安徽省微生物與生物催化工程技術(shù)中心，安徽 合肥 230039)

淀粉降解酶已經(jīng)占到全球酶制劑銷量的30%，成為市場份額最大的一類酶［1］。α-淀粉酶(α-amylases，E.C 3.2.1.1)是最重要的淀粉降解酶之一，可以把淀粉降解為系列寡糖，早期主要應(yīng)用在淀粉液化工藝中［2］。最近幾年，隨著一些具有耐有機(jī)溶劑、耐表面活性劑、耐堿或耐鹽等特色的α-淀粉酶的發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶的應(yīng)用范圍擴(kuò)大到了紡織、造紙、洗滌、醫(yī)藥等行業(yè)［3-4］。進(jìn)一步挖掘和開發(fā)具有新型催化特色的α-淀粉酶成為研究的熱點(diǎn)。最近，安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院從海洋宏基因組文庫中篩選獲得了一個新型的α-淀粉酶(AmyP)［5］。AmyP 的氨基酸序列與已知的 α-淀粉酶相似性極低(不超過20%)，而且又具有新型的進(jìn)化地位，因此，探索AmyP是否具有某些獨(dú)特的催化特性具有重要的價值。通過探索各類有毒物質(zhì)的耐受情況，發(fā)現(xiàn)AmyP具有良好的有機(jī)溶劑和表面活性劑耐受性，為了解這個新的α-淀粉酶以及開發(fā)新型的酶制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

α-淀粉酶AmyP是在基因工程菌中重組表達(dá)和純化的蛋白。重組表達(dá)載體pET32a-AmyP由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建［5］，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌 BL21(DE3)(Novagen公司)后，16℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h，AmyP蛋白通過Ni2+親和層析(GE Health公司)一步純化。分析純的有機(jī)溶劑購自國藥集團(tuán);麥芽三糖購自百靈威;表面活性劑、可溶性淀粉和3，5-二硝基水楊酸等試劑購自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 α-淀粉酶的酶活測定 采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測定可溶性淀粉降解后釋放出的還原糖的量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)［6］。一個標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系包含100 μL適當(dāng)稀釋的純酶和500 μL 1%可溶性淀粉。酶和淀粉均配置在100 mmol/L檸檬酸緩沖液(pH 6.5)中，50℃反應(yīng)5 min，立刻置于冰冷的0.3 mol/L Na2CO3溶液中終止反應(yīng)，隨后加入DNS試劑測定還原糖的量。一個標(biāo)準(zhǔn)酶活(U)定義為每分鐘釋放出1 μmol還原糖所需的酶量。蛋白濃度采用Bradford法測定，牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 有機(jī)溶劑對AmyP的影響 有機(jī)溶劑的毒性與其極性系數(shù)log Pow值(溶劑在辛醇/水雙相系統(tǒng)中的分配系數(shù)的對數(shù)值)密切相關(guān)。選擇不同log Pow值的有機(jī)溶劑，加入標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中，終濃度為20%(體積比)。以無添加的樣品組作為空白對照。

1.2.3 表面活性劑對AmyP的影響 選取陰離子型的表面活性劑SDS、陽離子型的表面活性劑CTAB、非離子型的表面活性劑 Tween-20、Tween-80和Triton X-100為檢測AmyP表面活性劑耐受性的試劑。將終濃度依次為0.5%、1%、2%和3%的表面活性劑與純酶在10℃浴鍋中孵育30 min，轉(zhuǎn)速 150 r/min，然后取 100 μL 酶液測定殘留的酶活。以無添加的樣品組作為空白對照。

1.2.4 水解產(chǎn)物的高壓液相色譜(HPLC) 測定AmyP水解可溶性淀粉的產(chǎn)物時，將反應(yīng)時間延長為30 min，以確保充分反應(yīng)。水解產(chǎn)物采用HPLC(Agilent 1260)進(jìn)行定量測定，使用的糖柱為Carbomix Ca-NP柱(250 mm×4.5 mm)(Sepax Technologies，Inc.，USA)，檢測手段為示差檢測，流動相為 MilliQ級的純水，流速0.1 mL/min，柱溫為80℃。標(biāo)準(zhǔn)品為葡萄糖(G1)、麥芽糖(G2)和麥芽三糖(G3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)溶劑對AmyP活性的影響

通常情況下，有機(jī)溶劑會使酶蛋白變性，從而喪失催化活性。選取8種 log POW值從4.5到－0.24的有機(jī)溶劑(20%，體積比)，它們對純化的重組表達(dá)的AmyP活性的影響如表1所示。

表1 不同有機(jī)溶劑對AmyP活性的影響Table 1 The effects of various organic solvents on the activity of AmyP

沒有添加有機(jī)溶劑的樣品組(純酶為154 U/mL)的酶活定義為100%。可見，在反應(yīng)體系中存在有機(jī)溶劑的條件下，AmyP依然保持了50%以上的活性，這表明AmyP對各種有機(jī)溶劑均具有良好的耐受性。一般認(rèn)為log Pow值在1.5～4.0之間的有機(jī)溶劑毒性較強(qiáng)，而低于1.5或高于4.0的有機(jī)溶劑毒性較弱［7］。AmyP對各種有機(jī)溶劑的耐受性強(qiáng)弱顯然與有機(jī)溶劑的毒性無顯著相關(guān)。尤其值得注意的是，在正辛醇、正辛烷和甲苯存在時，AmyP的活性不但沒有下降，反而提高為139%、118%和119%。最近幾年，隨著耐受有機(jī)溶劑的淀粉酶在制藥行業(yè)的開發(fā)應(yīng)用，一些具有這種新特性的α-淀粉酶被陸續(xù)報道。例如來自Bacillus agaradhaerens Mi-10-62 菌 株［8］、Thalassobacillus sp.LY18 菌株［9］、Haloarcula sp.S-1 菌株［10］等微生物中的 α-淀粉酶。這些 α-淀粉酶在有機(jī)溶劑存在的條件下，雖然活性顯示出不同程度的下降，但是依然維持了部分活性。據(jù)我們所知，已知文獻(xiàn)報道中只有1個來自Nesterenkonia sp.F菌株的α-淀粉酶在有機(jī)溶劑存在時顯示出更高的活性［11］。因此，AmyP在有機(jī)溶劑存在的生物技術(shù)中有潛在的優(yōu)良應(yīng)用前景。

2.2 正辛醇對AmyP水解產(chǎn)物的影響

AmyP是一個較為罕見的糖化型α-淀粉酶，其可溶性淀粉的水解產(chǎn)物不是系列寡糖，而是僅為葡萄糖(G1)、麥芽糖(G2)和麥芽三糖(G3)［5］。無添加條件下，HPLC測定這3個水解產(chǎn)物的相對比例為G1∶G2∶G3=13∶37∶50(圖1 A)。添加了正辛醇后，水解產(chǎn)物的相對比例改變?yōu)镚1∶G2∶G3=28∶34∶38，葡萄糖的含量明顯增多，麥芽三糖的含量相對減少(圖1 B)。此外，正辛烷和甲苯對AmyP的水解產(chǎn)物無明顯影響。雖然未見有機(jī)溶劑改變α-淀粉酶水解產(chǎn)物的報道，但是來自Brachybacterium sp.LB25菌株的麥芽三糖淀粉酶在DMSO或乙醇的影響下麥芽三糖的產(chǎn)量會明顯增加［12］;來自 Pseudomonas aeruginosa 的蛋白酶在甲醇、乙醇和異丙醇等不同有機(jī)溶劑存在時的水解產(chǎn)物各不相同［13］。

圖1 HPLC分析無添加(A)和添加正辛醇(B)后AmyP的淀粉水解產(chǎn)物Fig.1 HPLC analysis of starch-hydrolysis by AmyP in the absence(A)or presence(B)of n-octanol G1、G2 and G3 refer to glucose，maltose and maltotrios

2.3 表面活性劑對AmyP的影響

由于某些具有有機(jī)溶劑耐受性的酶類同時也具有表面活性劑耐受性［9］，因此選取常見的5種表面活性劑對AmyP進(jìn)行了測定，結(jié)果如圖2所示。AmyP對3種非離子型的表面活性劑耐受性很好，不僅無活性喪失，而且活性均有不同程度的提高。Tween-20的效果尤其明顯，1%的Tween-20可以提高酶活124%。但是，AmyP對陰/陽離子型的表面活性劑耐受性不佳。隨著陰/陽離子型的表面活性劑濃度的增加，AmyP的活性快速下降。通常，非離子型的表面活性劑毒性較低，而陰/陽離子型的毒性較強(qiáng)。因此，AmyP的表面活性劑耐受性強(qiáng)弱與表面活性劑的毒性基本吻合。這種特征與來自Thalassobacillus sp.LY18菌株［9］和 B.mojavensis A21 菌株［14］的 α-淀粉酶類似。比較B.mojavensis A21菌株來源的α-淀粉酶在Tween-20(5%)、Tween-80(5%)和 SDS(1%)處理后分別保留85%、83%和71%的酶活［14］，顯然AmyP的表面活性劑耐受性更高。此外，表面活性劑對AmyP的水解產(chǎn)物無明顯影響。

圖2 表面活性劑對AmyP穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of surfactants agents on the stability of AmyP

3 討論

α-淀粉酶 AmyP不僅對 log Pow值從4.5到－0.24的各種有機(jī)溶劑均具有良好的耐受性，而且耐受性強(qiáng)弱與有機(jī)溶劑的毒性無顯著相關(guān)。正辛醇、正辛烷和甲苯可以提高AmyP的活性。正辛醇還可以改變AmyP的淀粉水解產(chǎn)物，使葡萄糖的含量增加，麥芽三糖的含量降低。AmyP對非離子型的表面活性劑Tween-20、Tween-80和Triton X-100展示出優(yōu)良的耐受性，對陰離子型的SDS和陽離子型CTAB耐受性稍差。這些數(shù)據(jù)表明來自海洋宏基因組文庫的AmyP是一個同時具有有機(jī)溶劑和表面活性劑耐受性的新型α-淀粉酶。

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