HPLC-UV-MS/MS法對金線蓮中黃酮類組分的鑒定和測定

鄭成鳳，潘裕添，蔡文燕，苑小寧，高 飛*

1閩南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)系;2閩南師范大學(xué)菌物產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)中心，漳州 363000

金線蓮［Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl］為蘭科開唇蘭屬植物，為多年生珍稀中草藥，主要分布于我國福建、臺灣、云南等省，民間多用于治療支氣管炎、糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、小兒急驚風(fēng)及小兒破傷風(fēng)等疾病。金線蓮只能生于闊葉林下且常被樹葉遮蓋的陰濕地，對于生長的濕度、溫度、光度等因素極為苛求，并且自然繁殖成活率極低，野生金線蓮的資源蘊藏量很稀少。因此，近年來，國內(nèi)很多學(xué)者開始通過組織培養(yǎng)育苗技術(shù)對金線蓮進行人工栽培［1］，及對組培和野生金線蓮中化學(xué)成分進行對比分析研究。金線蓮的主要活性成分為多糖和黃酮類化合物，并含有少量有機酸、生物堿和甾體等［2-4］。其中黃酮類物質(zhì)水仙苷具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性［5］。雖然，研究結(jié)果證實金線蓮中含有水仙苷成分［6］，但對其含量測定的研究鮮有報道。因此，本文運用高效液相色譜-紫外-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-UV-MS)對金線蓮的醇提液中黃酮類化合物進行分離分析及含量測定，并對組織培養(yǎng)金線蓮和野生金線蓮中的水仙苷等黃酮類物質(zhì)的含量進行比較分析，以期為組培金線蓮的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent HPLC1200(含在線脫氣、四元泵、自動進樣器、柱溫箱和DAD檢測器)(美國安捷倫公司);Agilent 6320 Ion Trap LC/MSD(ESI離子源，美國安捷倫公司)。

福建金線蓮I、福建金線蓮II、臺灣金線蓮I和臺灣金線蓮II(均由潘裕添教授課題組培養(yǎng)提供);野生金線蓮(云南);水仙苷(異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷)、山奈酚和異鼠李素(純度≥98%，購自上海源葉生物科技有限公司);蘆丁(槲皮素-3-O-β-D-蕓香糖苷)和槲皮素(純度≥98%，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司);甲醇、乙醇和甲酸(分析純，西隴化工股份有限公司，均經(jīng)實驗室重蒸提純);乙腈(色譜純，德國默克試劑);超純水(Milli-Q Gradient)。

2 實驗方法

2.1 檢測條件

質(zhì)譜條件:離子源:ESI;檢測模式:負(fù)模式;霧化氣壓力(Nebulizer):35.0 psi;干燥氣流速(Dry Gas):12.0 L/min;干燥氣溫度(Dry Temp):325℃;掃描范圍為:50～1500 amu;毛細(xì)管出口電壓(Capillary Exit Voltage):-136.7 V;高壓毛細(xì)管(HV Capillary):3500 V;碎裂電壓(Fragmentation Amplitude):1.0 V;碎裂寬度(Fragmentation Width):4.00 m/z;碎裂時間(Fragmentation Time):40000 μs;碎裂延遲(Fragmentation Delay):0 μs。

液相色譜條件:保護柱:Eclipse XDB-C18Analytical Guard Column(4.6 × 12.5 mm，5 μm);色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 × 150 mm，5 μm);流速:0.5 mL/min;柱溫:35℃;檢測波長:368 nm;進樣體積:10 μL;流動相:0.03%甲酸水溶液(A)，乙腈(B);梯度洗脫程序如下:0～10 min，20%(B);10～12 min，20% ～24%(B);12 ～20min，24%(B);20～25min，24% ～30%(B);25 ～48min，30%(B)。

2.2 金線蓮中黃酮類化合物的提取

將金線蓮全草冷凍干燥，粉碎，備用。準(zhǔn)確稱取金線蓮樣品1.0000 g置于具塞三角燒瓶中，加入20.0 mL 80%乙醇溶液浸泡過夜(約24 h);次日，超聲15 min，靜置片刻，移取上清液，在殘渣中再加入20 mL 80%乙醇溶液超聲15 min，重復(fù)3次，合并4次上清液。過濾，減壓濃縮，以80%乙醇溶液定容至10 mL，得供試品溶液。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.3 對照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取蘆丁、槲皮素、水仙苷、山奈酚和異鼠李素，分別以甲醇溶解配制成含蘆丁1.04 mg/mL、槲皮素1.10 mg/mL、水仙苷1.01 mg/mL、山奈酚1.02 mg/mL和異鼠李素1.02 mg/mL的單一對照品溶液。

精密稱取蘆丁0.00316 g、水仙苷0.00605 g、槲皮素0.00095 g、山奈酚0.00100 g和異鼠李素0.00105 g，以甲醇溶解定容至25 mL，得到對照品混合儲備液。分別精密移取對照品混合儲備液0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 和 8.00 mL 置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至10 mL，配制成不同濃度的對照品混合液。

3 結(jié)果與討論

3.1 金線蓮的黃酮類組分的確定

精密吸取各單一對照品溶液、對照品混合溶液和福建金線蓮I供試品溶液10 μL，按照2.1液相色譜和質(zhì)譜檢測條件分別進行檢測分析。對單一對照品溶液和對照品混合溶液的色譜圖及其質(zhì)譜圖進行比較，確定色譜峰2、5、8、9 和10(圖1-A)分別為蘆丁、水仙苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素。根據(jù)對照品混合溶液和福建金線蓮I供試品溶液中對應(yīng)色譜峰的保留時間(見圖1)，以及相應(yīng)峰的一級及其二級質(zhì)譜碎片離子(見表1)，可確定該供試品溶液含有蘆丁、水仙苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素，進一步分析該供試品溶液的色譜圖和各色譜峰的一、二級質(zhì)譜圖，可初步推測該供試品溶液還含有其他5種黃酮類物質(zhì)，其對應(yīng)色譜峰為1、3、4、6和7(見圖1-B)。

圖1 對照品溶液(A)和福建金線蓮I供試品(B)的HPLC色譜圖(368 nm)Fig.1 HPLC-UV(at 368 nm)chromatograms of mixed reference substances(A)and Fujian ARL-I sample(B)

表1 福建金線蓮I供試品的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 1 MS and MS/MS data of Fujian ARL-I sample

圖2A～E分別為福建金線蓮I供試品溶液中1、3、4、6和7號色譜峰的一級和二級質(zhì)譜圖。由圖2-A可知，1號峰的一級質(zhì)譜圖中，基峰為［M-H］-離子峰，其質(zhì)荷比m/z=639.2，可推測為異鼠李素-3，7-O-β-D-二葡萄糖苷的準(zhǔn)分子離子峰;以639為目標(biāo)離子，所得的兩個碎裂離子的質(zhì)荷比分別為477.0 和 315.0，可推測為異鼠李素-3，7-O-β-D-二葡萄糖苷分別脫去一個和兩個葡萄糖基團的碎片離子［M-C6H10O5-H］-和［M-2C6H10O5-H］-，其結(jié)果與文獻［7］基本一致。由圖2-B可知，3號峰的一級質(zhì)譜圖中，基峰為［M-H］-離子峰，其質(zhì)荷比 m/z=463.2，可推測為槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的準(zhǔn)分子離子峰;以463為目標(biāo)離子，所得碎片離子的m/z=300.9，為槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷脫去1個葡萄糖基團的［M-C6H10O5-H］-離子峰，實驗結(jié)果與文獻［4，8］相符合。由圖2-C可知，4號峰的一級質(zhì)譜圖中，基峰m/z=593.2，可推測為山奈酚-3-O-β-D-蕓香糖苷的準(zhǔn)分子離子峰［M-H］-;以593為目標(biāo)離子，得到m/z=284.9的碎片離子，是山奈酚-3-O-β-D-蕓香糖苷裂解脫去蕓香糖基團后的［M-C12H20O9-H］-離子峰，實驗數(shù)據(jù)同文獻相一致［4，9］。由圖2-D 可知，6號峰的一級質(zhì)譜中，基峰為m/z=447.3，可推測是山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷的準(zhǔn)分子離子峰［M-H］-;以447為目標(biāo)離子，所獲得碎片離子m/z=284.9，為山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷脫去1個葡萄糖基團的［M-C6H10O5-H］-離子，同時在低質(zhì)量區(qū)出現(xiàn)了山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷特有的碎片離子峰 m/z=255.1和m/z=151，實驗結(jié)果與文獻相一致［8］。由圖2-E可知，7號峰的一級質(zhì)譜圖中，基峰為［M-H］-離子峰，其質(zhì)荷比m/z=477.1，推測為異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷，以477為目標(biāo)離子，其二級質(zhì)譜所獲得的碎片離子的質(zhì)荷比為314.1，為異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷脫去一個葡萄糖自由基而產(chǎn)生的［M-C6H11O5-H］-離子，并且產(chǎn)生 m/z=357.0、285.1、271.0和151.0離子碎片，所得實驗數(shù)據(jù)與文獻相符合［7，10］。

通過分析不同來源的金線蓮供試品溶液的HPLC色譜和質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)所含黃酮類化合物不盡相同(見表2)，其中以福建金線蓮I、福建金線蓮II和臺灣金線蓮II含黃酮類化合物成分最豐富。

3.2 HPLC-UV方法學(xué)考察

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密吸取不同濃度的對照品混合液10 μL，按照2.1的液相色譜條件進行測定。以對照品的濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，液相色譜峰的平均峰面積(A，mAU)為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢測限見表3。結(jié)果表明這些化合物在對應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，其峰面積值和濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

圖2 福建金線蓮I供試品中未知組分的一級、二級質(zhì)譜圖Fig.2 MS and MS/MS spectra of unknown components of Fujian ARL-I sample

表2 金線蓮樣品中黃酮類化合物的組分Table 2 Components of flavonoids of ARL samples

表3 對照品的線性回歸方程和檢測限(n=8)Table 3 The regression equations and LOD for five reference substances(n=8)

3.2.2 精密度

取對照品混合液10 μL，連續(xù)進樣6次，按照2.1的色譜條件進行測定。蘆丁、槲皮素、水仙苷、山奈酚和異鼠李素的色譜峰面積的RSD(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)和保留時間的RSD均小于0.50%，表明儀器的精密度良好。

3.2.3 穩(wěn)定性

取福建金線蓮I供試品，室溫環(huán)境下分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、36 h、48 h 時進樣10 μL進行測定，各黃酮類組分的色譜峰面積的RSD均小于1.87%，表明供試品溶液在48 h之內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.4 回收率

取福建金線蓮I樣品6份，分別加入3個不同濃度的對照品混合液(每個濃度2份)，按照2.1的色譜條件測定，計算平均回收率，結(jié)果見表4，蘆丁、槲皮素、水仙苷、山奈酚和異鼠李素回收率均在98～106%范圍內(nèi)，符合國家藥典要求。

表4 福建金線蓮I的回收率(n=3)Table 4 Recoveries of the five flavonoids in Fujian ARL-I(n=3)

3.3 樣品的測定

將福建金線蓮I、福建金線蓮II、臺灣金線蓮I、臺灣金線蓮II和野生金線蓮樣品分別按照2.2方法制成供試品溶液，在2.1的色譜條件進行測定，以外標(biāo)法計算蘆丁、水仙苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素的含量(見表5)。結(jié)果表明福建金線蓮I、II包含了野生金線蓮的黃酮類成分，且含量較高，故以福建組培金線蓮代替野生金線蓮是可行的。而臺灣組培金線蓮所含黃酮類組分和含量同野生金線蓮相差較大，說明該組培方法有待進一步優(yōu)化和改善。

表5 金線蓮樣品中5種化合物的含量(n=2)Table 5 Content of five compounds detected in five samples of ARL(n=2)

4 結(jié)論

根據(jù)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、二級質(zhì)譜碎片離子提供的信息和相關(guān)文獻報道，確定出金線蓮中含有10種黃酮類組分;異鼠李素-3，7-O-β-D-二葡萄糖苷、蘆丁、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-蕓香糖苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷和異鼠李素為共有組分，其中水仙苷的含量最為豐富。實驗結(jié)果還表明，組培福建金線蓮比野生金線蓮含有的黃酮類組分多且含量大，有替代野生金線蓮潛力。本研究所建立的方法簡便快捷，選擇性好，可為金線蓮組織培養(yǎng)質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 Liu RD(劉潤東)，Guo WJ(郭文杰)，Lin ZN(林忠寧)，et al.Tissue culture and nutrient contents analysis of Anoectochilus roxburghii.Guangxi Agric Sci(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué))，2006，37:506-509.

2 He CN(何春年)，Wang CL(王春蘭)，Guo SX(郭順星)，et al.Study on chemical constituents of Anoectochilus roxburghii(III).Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2005，17:259-262.

3 Cai JY(蔡金艷)，Gong LM(宮立孟)，Zhang YH(張勇慧)，et al.Studies on chemical constituents from Anoectochilus roxburghii．J Chni Med Mater(中藥材)，2008，31:370-372.

4 Wang XX(王曉雪).Study on rapid mass spectrometric analytical method and correlation spectroscopy of NMR/RRLCMS of constituents in the crude extract of Anoectochilus roxburghii.Beijing:Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院)，PhD.2011.

5 Ribonnet L，Callebaut A，Nobels I，et al.Modulation of CYP1A1 activity by a Ginkgo biloba extract in the human intestinal Caco-2 cells.Toxicol Lett，2011，202:193-202.

6 Wang XX，He JM，Wang CL，et al.Simultaneous structural identification of natural products in fractions of crude extract of the rare endangered plant Anoectochilus roxburghii using1H NMR/RRLC-MS parallel dynamic spectroscopy.Int J Mol Sci，2011，12:2556-2571.

7 Auger B，Marnet N，Gautier V，et al.A detailed survey of seed coat flavonoids in developing seeds of Brassica napus L．J Agric Food Chem，2010，58:6246-6256.

8 Chang Q，Wong YS.Identification of flavonoids in hakmeitau beans(Vigna sinensis)by high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry(LC-ESI/MS).J Agric Food Chem，2004，52:6694-6699.

9 Seyer A，Einhorn J，Brunelle A，et al.Localization of flavonoids in seeds by cluster time-of-flight secondary ion mass spectrometry imaging.Anal Chem，2010，82:2326-2333.

10 Sriseadka T，Wongpornchai S，Rayanakorn M.Quantification of flavonoids in black rice by liquid chromatography-negative electrospray ionization tandem mass spectrometry.J Agric Food Chem，2012，60:11723-11732.