重金屬脅迫下芫荽生理及揮發(fā)性成分變化分析

魏金鳳，李光勇，王俊霞，康文藝*

1河南大學(xué)中藥研究所;2河南大學(xué)民生學(xué)院，開(kāi)封 475004;3河南醫(yī)藥技師學(xué)院，開(kāi)封 475008

芫荽為傘形科植物芫荽(Coriandrum sativum L.)的帶根全草［1］。又名香菜，香荽和胡荽等，一年生或兩年生草本，因其有濃郁香氣而得名。我國(guó)各地均有栽培，對(duì)磷肥的反應(yīng)最為敏感，磷肥可提高種子精油的含量。芫荽味辛，性溫。歸肺、脾、肝經(jīng)。主治風(fēng)寒感冒，麻疹，痘疹透發(fā)不暢，食積氣滯，脘腹脹痛或嘔惡，此外，芫荽有升散止痛之功，又有解毒行散之能。芫荽全草及果實(shí)均可入藥，莖葉作蔬菜和調(diào)香料，有健胃消食作用;果入藥，有驅(qū)風(fēng)、透疹、健胃、祛痰之效［2］。

國(guó)內(nèi)外對(duì)使用不同提取方法所得揮發(fā)油的報(bào)道頗多，但還未見(jiàn)用固相微萃取技術(shù)提取芫荽揮發(fā)性成分的報(bào)道。前人的研究集中在芫荽揮發(fā)油體外抗菌和抗氧化活性方面。周凌霄等［3］對(duì)芫荽精油的研究表明，對(duì)大腸桿菌和白葡萄球菌的抑制作用。J.C.Matasyoh［4］等報(bào)道水蒸氣蒸餾法所得芫荽揮發(fā)油對(duì)G+金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌以及G-埃希氏菌屬、沙門氏菌等顯示有顯著抑菌活性。另有研究發(fā)現(xiàn)，芫荽水提物可減輕抗原蟲(chóng)藥物甲硝唑引起的基因毒害效應(yīng)［5］。陸占國(guó)等［6］報(bào)道超聲波法和水蒸氣蒸餾法得到的芫荽莖葉精油具有明顯地清除亞硝酸鹽作用，水蒸氣蒸餾法［7］得到的精油亦具有很強(qiáng)的清除DPPH自由基能力，具有很好的抗氧化活性。

土壤系統(tǒng)中的重金屬污染與治理一直是國(guó)際上的難點(diǎn)與熱點(diǎn)研究課題［8］。受重金屬離子脅迫的植物可啟動(dòng)多種機(jī)制提高對(duì)重金屬的抗性。從而降低重金屬離子對(duì)組織細(xì)胞的毒害。植物體內(nèi)的潛在機(jī)制主要是通過(guò)避免重金屬離子在細(xì)胞內(nèi)敏感位點(diǎn)大量積聚，并產(chǎn)生避免重金屬離子傷害作用的可溶性蛋白質(zhì)，使植物增強(qiáng)傷害躲避能力和自我平衡能力。過(guò)去的研究大多只注重于單個(gè)污染物在土壤中的遷移及對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，隨著人們對(duì)環(huán)境問(wèn)題的認(rèn)識(shí)不斷深入，研究的重點(diǎn)也轉(zhuǎn)向多種污染物復(fù)合污染的研究。本實(shí)驗(yàn)選擇的實(shí)驗(yàn)材料芫荽不僅有食用價(jià)值，而且有藥用價(jià)值，因此研究重金屬污染對(duì)它的影響是十分有意義的，關(guān)系到食品安全及用藥安全。

1 材料與儀器

1.1 材料

芫荽種子(2011年4月，購(gòu)于河南省開(kāi)封市金明區(qū)市場(chǎng))。

1.2 儀器

紫外分光光度計(jì)、離心機(jī)、水浴鍋、磁力攪拌器、酸式滴定管、電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(美國(guó)Perkin Elmer公司，Optima 2100 DV);6890 N型氣相色譜-5975型質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司);手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器和 65 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS-DVB)萃取頭(美國(guó)Supelco公司);C6-C26正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Alfa Aesar公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 廢電池浸出液的制備

取華太5號(hào)鋅錳干電池若干節(jié)，破壞后按1∶20的固液比加入Hoagland營(yíng)養(yǎng)液［9］，溶液用磁力攪拌器攪拌48 h，靜置1 d，再攪拌48 h后，靜置1 d用吸管取無(wú)色透明上清液待實(shí)驗(yàn)使用，所得為浸出原液(以下稱原液)。以原液為基礎(chǔ)稀釋100、50、10倍后得到3個(gè)梯度質(zhì)量分?jǐn)?shù)的廢舊電池脅迫液。使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測(cè)得原液中Cr、Cd、Co、Ni、Zn、Mn 的含量依次為 8.8、7.4、13.6、7.8、478.4、144.2 mg/L。

2.2 幼苗的培養(yǎng)及脅迫

實(shí)驗(yàn)于2011年4月開(kāi)始進(jìn)行，將芫荽種子均勻撒于裝土帶孔的托盤中，每天光照12 h，傍晚澆水1次，待種子發(fā)芽后將植株從盤中脫出，洗凈根系，移至裝有蛭石的小盆中，置于托盤中。植株在蛭石中適應(yīng)至長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定后，改用經(jīng)Hoagland營(yíng)養(yǎng)液稀釋不同倍數(shù)的廢舊電池脅迫液隔天進(jìn)行脅迫處理。于每天上午9點(diǎn)澆灌脅迫液，隔天脅迫，共處理7次。脅迫開(kāi)始后的第15 d，從植株上剪取中部莖段的葉片進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定。

2.3 測(cè)定方法

參照文獻(xiàn)［10］方法，考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定可溶性蛋白含量;硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定過(guò)氧化物脂質(zhì)MDA含量;愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性;氮藍(lán)四唑(NBT)還原法測(cè)定SOD活力;磺基水楊酸法測(cè)定游離脯氨酸含量;苯酚法測(cè)定可溶性糖含量。參照文獻(xiàn)［11］，高錳酸鉀滴定法測(cè)定CAT活力，丙酮-無(wú)水乙醇等體積混合法測(cè)定葉綠素含量。

2.4 實(shí)驗(yàn)方案

芫荽幼苗在蛭石中長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定之后開(kāi)始處理，以Hoagland營(yíng)養(yǎng)液為對(duì)照，廢舊電池原液用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液分別稀釋100倍、50倍和10倍3個(gè)梯度澆灌，每個(gè)處理重復(fù)3次。

2.5 揮發(fā)性成分的測(cè)定

2.5.1 揮發(fā)性成分的提取

將各試驗(yàn)組芫荽在脅迫開(kāi)始的第15 d拔出，洗凈根系，陰干。使用前先將SPME的萃取纖維頭在氣相色譜的進(jìn)樣口老化10 min，老化溫度為250℃，載氣體積流量為1.0 mL/min。取各組陰干芫荽葉各0.7 g，置于5 mL的樣品瓶中，蓋上蓋子，插入65 μm PDMS萃取纖維頭，于80℃下頂空取樣30 min后，立即取出，在氣相色譜儀進(jìn)樣口(250℃)，脫附1 min。

2.5.2 GC/MS分析條件

HP-5 MS石英彈性毛細(xì)管柱(30.0 m ×250 μm，0.25 μm);載氣為高純氦氣(99.999%)，流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度為250℃;色譜柱初始溫度50℃(保持1.0 min)，以3℃/min升溫至120℃(保持2 min)，最后以4℃/min升溫至210℃(保持10 min)。不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件:電離方式:EI源，電離能量70 eV;離子源溫度為250℃;四極桿溫度150℃;傳輸線溫度為280℃;四級(jí)桿溫度為150℃;電子倍增器電壓1765 V。質(zhì)量掃描范圍為30～440 amu，譜圖檢索:采用RTLPEST3.L和NIST05.L進(jìn)行檢索。

2.5.3 保留指數(shù)測(cè)定

按照文獻(xiàn)［12］，測(cè)定各組分的保留時(shí)間，計(jì)算出各組分的Kovats保留指數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 生理指標(biāo)的變化

廢電池浸出液脅迫對(duì)芫荽幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、活性氧系統(tǒng)、膜脂過(guò)氧化水平等的影響如圖1～3。

圖1 廢電池浸出液脅迫對(duì)芫荽幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Fig.1 Effect of waste battery lixivium stress on contents of osmotic adjustment components of seedling leaves of C．sativum

由圖1可以看出，隨著廢電池浸出液稀釋倍數(shù)的減小，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白含量均呈先升后降的趨勢(shì)，可溶性糖和游離脯氨酸均在稀釋100倍組含量達(dá)到最大值，分別為對(duì)照組的1.24倍、4.30倍，之后迅速下降。可溶性蛋白含量在稀釋50倍組含量達(dá)到最大值，為對(duì)照組的1.25倍，稀釋10倍組稍有下降。一般認(rèn)為，重金屬脅迫下植物體內(nèi)碳水化合物代謝紊亂，蛋白質(zhì)的代謝變化也將在一定程度上直接反映植物對(duì)重金屬脅迫的抗性適應(yīng)能力大小，細(xì)胞內(nèi)可溶性脅迫蛋白含量增加可以使植物組織細(xì)胞減輕傷害，也可參與滲透調(diào)節(jié)?？傆^上圖，不同濃度廢電池浸出液處理組的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)中，可溶性糖和脯氨酸含量變化較為明顯，說(shuō)明芫荽幼苗中可溶性糖和脯氨酸對(duì)重金屬脅迫響應(yīng)靈敏，芫荽通過(guò)積累這些小分子有機(jī)化合物，降低植物體內(nèi)滲透勢(shì)，增強(qiáng)植物組織和體細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，以利于逆境脅迫下維持植物體正常生長(zhǎng)所需水分，穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)，抵抗重金屬脅迫，在一定程度上減弱重金屬對(duì)植物體的毒害效應(yīng)，提高抗逆性，是芫荽適應(yīng)重金屬脅迫的重要機(jī)制之一。由圖1看出，各濃度電池浸出液脅迫后，脯氨酸含量均高于對(duì)照組，但污染濃度較高時(shí)，脯氨酸及可溶性糖積累量卻與受脅迫濃度呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明脅迫液濃度增加至一定程度時(shí)，幼苗抗重金屬污染能力將有所減弱。

圖2 廢電池浸出液脅迫對(duì)芫荽幼苗葉片活性氧系統(tǒng)CAT、SOD活力的影響Fig.2 Effect of waste battery lixivium stress on CAT and SOD activities of seedling leaves of C．sativum

圖3 廢電池浸出液脅迫對(duì)芫荽幼苗葉片POD活力及MDA含量的影響Fig.3 Effect of waste battery lixivium stress on MDA content and POD activity of leaves of C．sativum

活性氧系統(tǒng)及膜脂過(guò)氧化水平是植物抗逆性的重要指標(biāo)。植物膜保護(hù)的三大酶系—SOD、POD和CAT是細(xì)胞中防止ROS過(guò)量產(chǎn)生的重要抗氧化酶系統(tǒng)［13］。由圖2、3可以看出，在廢電池浸出液脅迫誘導(dǎo)下，芫荽幼苗葉片中SOD、POD活性變化趨勢(shì)一致，隨著電池浸出液稀釋倍數(shù)的減小，即重金屬污染程度的上升，二者活性比對(duì)照組明顯增加，在稀釋50倍組，活性達(dá)到最大值，分別為對(duì)照組的3.15倍、6.04倍，再減小稀釋倍數(shù)至10倍，SOD、POD活力分別下降至對(duì)照組的2.47倍、3.94倍，仍顯著高于對(duì)照組。CAT活力在稀釋100倍組最大，為對(duì)照組的1.32倍，隨著稀釋倍數(shù)的減小，CAT活力依次為對(duì)照組的107%、96.41%。抗氧化酶系統(tǒng)中，SOD是防御活性氧的關(guān)鍵酶，能夠歧化超氧陰離子自由基為O2和H2O2，而POD和CAT則催化H2O2形成H2O和 O2，只有 SOD、POD、CAT三者協(xié)調(diào)一致，才能使植物體內(nèi)活性氧自由基維持在較低的水平，使植物進(jìn)行正常的生長(zhǎng)和代謝。在廢電池浸出液復(fù)合重金屬污染條件下，芫荽葉片中的SOD、POD活性隨著稀釋倍數(shù)的減小，污染程度的加深，活性明顯增加，說(shuō)明這兩種酶在芫荽幼苗對(duì)復(fù)合重金屬的抗性中起到主要作用。MDA含量受SOD和POD協(xié)同控制，是反映膜脂過(guò)氧化水平的重要指標(biāo)之一，能與細(xì)胞內(nèi)各種成分發(fā)生反應(yīng)，引起酶與質(zhì)膜損傷，MDA含量變化與膜透性變化呈正相關(guān)，反映植物受逆境傷害的程度［14］，電池浸出液稀釋 100倍、50倍、10倍組的MDA含量分別是對(duì)照組的165.82%、112.03%、105.91%。MDA含量總體呈增加趨勢(shì)，說(shuō)明在復(fù)合重金屬脅迫下抗氧化酶活性有所增加，但芫荽幼苗的質(zhì)膜在一定程度上受損。

3.2 芫荽葉片中揮發(fā)性成分的測(cè)定

按2.5所述實(shí)驗(yàn)方法和條件，對(duì)固相微萃取法提取的芫荽葉揮發(fā)性成分進(jìn)行GC/MS分析，計(jì)算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索(RTLPEST3.L和NIST05.L)，面積歸一化法確定各成分的百分含量，各組分按照從氣相色譜HP-5MS柱中流出的順序，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同脅迫處理對(duì)芫荽葉中揮發(fā)性成分及含量的影響Table 1 Effect of waste battery lixivium stress on the volatile components of C．sativum leaves

由表1可以看出，芫荽葉的揮發(fā)性成分主要以不飽和脂肪酸酯、飽和烷烴、醛、醇為主。與索氏提?。?5］和超聲提取［6］所得精油成分有較大差別。其中異戊醛、壬烷、癸酸甲酯、n-棕櫚酸僅在廢電池浸出液脅迫組中檢測(cè)到，說(shuō)明芫荽幼苗在電池浸出液復(fù)合污染條件下，通過(guò)自身代謝的調(diào)節(jié)，合成新的揮發(fā)性成分。4，5-二(甲氨基)芴在對(duì)照組及稀釋100倍組檢測(cè)得到，稀釋50倍及10倍組，檢測(cè)不到該組分。2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇二異丁酸酯含量最高(對(duì)照組為13.36%)，在受到輕微重金屬污染下(稀釋100倍組)，含量有所升高，為對(duì)照組的118.10%，隨著重金屬污染程度的加深，含量下降，稀釋10倍組，該組分含量為對(duì)照組的75.30%。亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯含量的變化均在稀釋50倍組達(dá)到最大值，分別為對(duì)照組的112.66%、150.70%。由此可知，芫荽幼苗在重金屬污染調(diào)節(jié)下，揮發(fā)性成分的種類及含量會(huì)發(fā)生一定的變化，從而可能影響芫荽精油的抗菌、抗氧化等生物活性。

4 結(jié)語(yǔ)

本文對(duì)廢電池浸出液脅迫下的芫荽幼苗從生理及揮發(fā)性成分兩個(gè)方面綜合評(píng)價(jià)復(fù)合重金屬污染對(duì)芫荽食用和藥用價(jià)值的影響。試驗(yàn)選擇開(kāi)始脅迫后第15 d測(cè)定芫荽葉片中生理指標(biāo)的變化，在于此時(shí)處于幼苗期的芫荽，不同稀釋倍數(shù)重金屬溶液脅迫組表觀差異明顯，與對(duì)照組相比，隨著脅迫程度加深，芫荽葉片顏色由嫩綠逐漸轉(zhuǎn)為深綠，葉片萎蔫，葉面積減小，葉片生長(zhǎng)受阻。芫荽在受到重金屬脅迫時(shí)，通過(guò)主動(dòng)積累各種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)抵抗逆境，如芫荽葉中可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白含量在受到輕度脅迫時(shí)含量升高，亦由本課題組對(duì)荊芥的脅迫研究結(jié)果中加以證明［16］。細(xì)胞內(nèi)酶系統(tǒng)總的變化趨勢(shì)為合成酶類活性下降，而水解酶類及某些還原酶類活性增高。植物受到輕中度逆境脅迫時(shí)，保護(hù)酶體系的主要酶類超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)活性上升，重度逆境脅迫時(shí)，其活性將有不同程度下降［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，在適度的廢電池浸出液脅迫條件下(稀釋100倍)，芫荽幼苗抗氧化酶活性增高，清除活性氧的能力增強(qiáng);隨脅迫液濃度上升，抗氧化酶活性有下降趨勢(shì)，且呈濃度依賴性，導(dǎo)致幼苗抵御活性氧能力減弱，表明芫荽幼苗具有一定的抗重金屬污染能力。另外，某些揮發(fā)性成分在對(duì)照組中檢測(cè)不到，卻在受重金屬脅迫的芫荽幼苗葉片中檢測(cè)出來(lái)。廢舊電池浸出液中含有多種重金屬離子，復(fù)合作用十分復(fù)雜，可能因植物組織或部位不同，重金屬濃度和比例不同，引起表觀生理指標(biāo)及揮發(fā)性成分含量變化。這些成分含量的變化表明，芫荽生長(zhǎng)在受到較低濃度重金屬離子脅迫時(shí)，機(jī)體內(nèi)部通過(guò)自身代謝的調(diào)節(jié)抵御逆境，及某些特定酶的參與，進(jìn)而引起芫荽揮發(fā)油中具有天然活性的揮發(fā)性成分的變化，其藥用價(jià)值是否隨之受影響及影響的大小，有待進(jìn)一步深入的研究。

1 The editorial board of Chinese Material Medium.Chinese Materia Medica(中華本草).Shanghai:Shanghai Scientific＆ Technical Publishers，1999.Vol 15，935-938.

2 Flora of China editorial committee of Chinese academy of sciences.Flora of China(中國(guó)植物志).Shanghai:Shanghai Scientific ＆ Technical Publishers，2010.55(1)，89.

3 Zhou LX(周凌霄)，Yang RH(楊榮華)，Yue FH(岳富浩).Research on the bacteriostasis effect of coriander.Chin Condi(中國(guó)調(diào)味品)，2001，3:20-21.

4 Matasyoh JC，Maiyo ZC，Ngure RM，et al.Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of Coriandrum sativum.Food Chem，2009，113:526-529.

5 Talapatra SN，Dasgupta S，Guha G，et al.Therapeutic efficacies of Coriandrum sativum aqueous extract against metronidazole-induced genotoxicity in Channa punctatus peripheral erythrocytes.Food Chem Toxicol，2010，48:3458-3461.

6 Lu ZG(陸占國(guó))，Guo HZ(郭紅轉(zhuǎn))，Li W(李偉).Extraction of essential oil in coriander leaf by ultrasonic method and analysis of the components and effect of scavenging sodium nitrite.Chem Adhesion(化學(xué)與黏合)，2006，28:218-221.

7 Wang SM(王順民)，Guo HZ(郭紅轉(zhuǎn))，Lu ZG(陸占國(guó)).Coriander stem/leaf essential oil:GC/MS analysis and effects of scavenging DPPH radical.J Chin Cereals Oils Assoc(中國(guó)糧油學(xué)報(bào))，2008，23:99-102.

8 Liu F(劉芬).Soil contamination by heavy metals in Qingshuitang region:investigation and integrated concept of landuse.J Agric Envir Protect(農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù))，1998，4:162-164.

9 Lin LD(林立東).Study of main physiological activity matter change from Malva sylvestris seedling under heavy metal solution stress.J Sci Teach Coll Univ(高師理科學(xué)刊)，1998，4:162-164.

10 Li HS(李和生).Principles and Techniques of Plant Physiological Biochemical Experiment(植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)).Beijing:Higher Education Press，2006.164.

11 Zhang XZ(張憲政).Grop Physiology Research Method(作物生理研究法).Beijing:China Agriculture Press，1992.211.

12 Kang WY，Ji ZQ，Wang JM.Composition of the essential oil of Adiantum flabellulatum.Chem Nat Compd，2009，45:575.

13 Elstner EF.Oxygen activation and oxygen toxicity.Plant Physiol，1982，33:73-96.

14 Li Y(李妍).Effect of lead and cadmium stress on antioxidant enzymes activities and malondialdehyde concentration of Whea.J Triticeae Crops(麥類作物學(xué)報(bào))，2009，29:514-517.

15 Lu ZG(陸占國(guó))，Guo HZ(郭紅轉(zhuǎn))，Sun SM(孫勝敏).Chemical constituents and antibacterial activity of the essential oil from coriander leaf by Soxhlet's extraction.Chem Res(化學(xué)研究)，2007，18:70-73.

16 Wei JF(魏金鳳)，Wang JX(王俊霞)，Kang WY(康文藝).Effects of waste batteries leaching solution stress on resistance physiological indices of volatile constituents from Schizonepeta tenuifolia.Chin J Chin Mater Med(中國(guó)中藥雜志)，2011，36:2047-2050.

17 Yang YL(楊穎麗)，Yang N(楊寧)，Wang L(王萊)，et al.Effect of salinity on the physiological characteristics in two wheat cultivars.J Lanzhou Univ，Nat Sci(蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)，自科版)，2007，43(2):29-34.