蘆丁稀土釤配合物的自由基清除及抑菌作用

林建原，陸 興

浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，寧波 315100

稀土是化學(xué)元素周期表中的鑭系元素以及與鑭系的15個(gè)元素密切相關(guān)的兩個(gè)元素—鈧和釔共17種元素［1］。稀土元素具有特殊的理化性質(zhì)，在石油化工、玻璃陶瓷、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥等方面有廣泛的應(yīng)用［2］。近年來(lái)，隨著人們對(duì)稀土元素的深入研究，發(fā)現(xiàn)稀土元素具有特殊的生物學(xué)效應(yīng)［3］。蘆丁是一種黃酮類化合物，在植物體中的根、莖、葉、種子、果實(shí)中廣泛存在［4］，例如蕓香科的蕓香草，豆科的槐米，蓼科的蕎麥等都含有蘆?。?］，可用于防治腦溢血、視網(wǎng)膜出血、高血壓、急性出血性腎炎，治療風(fēng)濕性頭痛等。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于蘆丁的抗氧化性和清除自由基活性已有深入研究，但對(duì)蘆丁及其稀土配合物的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本文合成了蘆丁稀土釤配合物，測(cè)定了蘆丁及其配合物清除自由基的能力，同時(shí)通過(guò)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌實(shí)驗(yàn)，研究蘆丁及其稀土配合物的抑菌性能。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

F-4500型熒光分光光度計(jì)(日本日立公司);HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司);DZF-6020真空干燥箱(上?；厶﹥x器制造有限公司);SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(上海青浦滬西儀器制造有限公司);UV-3200PCS紫外分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司);AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);DL-1電爐(上海錦凱科學(xué)儀器有限公司);TC-15套式恒溫器(新華醫(yī)療器械廠);SW-CJ-ICU無(wú)菌操作臺(tái)潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);Vertex 70傅立葉紅外光譜儀(德國(guó)Bruker公司);游標(biāo)卡尺。

1.1.2 試劑及配制

蘆丁(BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);氧化鑭(99.99%，阿拉丁);無(wú)水乙醇(AR);濃鹽酸(AR);雙氧水(AR);小牛浸膏(杭州微生物實(shí)際有限公司);蛋白胨(BR，上海展云化工有限公司);NaCl(99.5%);瓊脂(BR，上海展云化工有限公司);無(wú)水 Na2CO3(AR);KBr(AR);苯甲酸鈉(AR，);鄰苯三酚(AR);硫酸亞鐵銨(AR);Tris(三羥甲基氨基甲烷，BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);EGTA(乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸，AR);DPPH·(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，96%，阿拉丁)，合成的釤蘆丁配合物和蘆丁分別用二甲基亞砜溶解，EGTA用氫氧化鈉溶解，DPPH·用無(wú)水乙醇溶解。

1.2 試驗(yàn)部分

1.2.1 蘆丁-釤配合物的合成

稱取適量氧化釤于一小燒杯中，加雙氧水3～5 mL，逐滴滴加1∶1鹽酸至固體氧化釤全部溶解，在水浴鍋中加熱至基本無(wú)氣泡，將溶液在電爐上蒸干，除去過(guò)量的雙氧水、鹽酸以及多余的水分得到稀土氯化物粉末，蒸去。

稱取1 mmol蘆丁，加100 mL無(wú)水乙醇，微熱攪拌使蘆丁溶解，向蘆丁乙醇溶液中加入適量的2.0 mmol無(wú)水碳酸鈉，2.2 mmol稀土氯化物粉末，在100～110℃回流4 h，抽濾，經(jīng)無(wú)水乙醇洗滌固體2～3次，放入真空干燥中60℃下干燥至恒重得到棕黃色固體。

1.2.2 羥基自由基(·OH)清除活性［6］

在燒杯中依次加入0.4 mL 3.8 mmol/L的EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)、0.2 mL 0.01 mol/L的苯甲酸鈉溶液、3.2 mL的蒸餾水、2 mL 3.8 mmol/L的硫酸亞鐵銨溶液、0.2 mL的雙氧水，快速搖勻并且倒入石英比色皿中，以300 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，415 nm為發(fā)射波長(zhǎng)，立即測(cè)定在此波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度，繪制動(dòng)力學(xué)曲線，該曲線于0～6 min部分的斜率為k0。

蘆丁和蘆丁-釤配合物的熒光動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定:分別配制6種不同濃度的蘆丁和蘆丁-釤配合物濃度，按照上述試劑加入順序，蒸餾水加入量依次變?yōu)?.0、2.8、2.6、2.4、2.2、2.0 mL，且在加入雙氧水之前分別加入樣品 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，用2.2.2同方法測(cè)定該曲線0～6 min的斜率為k。以下列公式計(jì)算蘆丁和蘆丁-釤配合物對(duì)羥基自由基的抑制率:

研究氧自由基的清除有直接法和間接法［9］。在燒杯中依次加入4 mL的Tris.HCl緩沖液、1.4 mL的蒸餾水、0.6 mL的鄰苯三酚，快速搖勻并且倒入石英比色皿中，以448 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，500 nm為發(fā)射波長(zhǎng)，立即測(cè)定在此波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度，繪制動(dòng)力學(xué)曲線，該曲線0～6 min部分的斜率為k0。

測(cè)定蘆丁和蘆丁-釤配合物的熒光動(dòng)力學(xué)曲線:分別配制6種不同濃度的蘆丁和蘆丁-釤配合物，用上述同方法測(cè)定，該曲線0～6 min部分的斜率為k。按下列公式計(jì)算蘆丁和蘆丁-釤配合物對(duì)氧自由基的抑制率:

1.2.4 DPPH·自由基清除活性［6］

取2.0 mL 0.3 mmol/L的DPPH·自由基，加蒸餾水定容至10 mL。放置30 min，以蒸餾水為空白，測(cè)定517 nm波長(zhǎng)處的吸光度，此為A0，另取12個(gè)比色管，加入2.0 mL的DPPH·自由基和不同量的樣品液，用蒸餾水定容至10 mL，按上述相同方法測(cè)定其吸光度，此為A，按下列公式計(jì)算蘆丁和蘆丁-釤配合物對(duì)DPPH·自由基的抑制率:

1.2.5 抑菌能力

1.2.5.1 制備培養(yǎng)基［7］

稱取蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉膏3 g，瓊脂15～20 g于燒杯中，加入蒸餾水1000 mL用電爐加熱溶解至顏色呈透明，在加熱過(guò)程中不斷用玻璃棒攪拌，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，倒入錐形瓶中在121℃高壓滅菌鍋中滅菌30 min備用。

1.2.5.2 接種

將培養(yǎng)基加入1000 mL錐形瓶中，在121℃滅菌后倒平板放到37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，去除染菌的培養(yǎng)基，然后在無(wú)菌室內(nèi)接入大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。接種完畢后在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.5.3 抑菌試驗(yàn)

(1)樣品的制備:將蘆丁用乙醇溶解，配制濃度為2.6 mg/mL的溶液，蘆丁-釤配制成2.5 mg/mL濃度的溶液。

(2)紙片的制備:剪取直徑約6 mm的紙片在121℃的滅菌鍋中滅菌后，于無(wú)菌室中將紙片分別浸泡于蒸餾水、DMSO溶液，蘆丁、蘆丁-稀土釤中，取出置干燥箱中干燥后保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 配合物的光譜表征

2.1.1 紅外光譜分析

用KBr壓片法測(cè)得蘆丁-釤配合物和蘆丁的紅外特征吸收光譜，見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁-釤配合物(1)與蘆丁(2)的紅外光譜Fig.1 The IR-VIS spectra of Rutin-Sm complex(1)and rutin(2)

由表1的主要吸收頻率可知，蘆丁和蘆丁-釤在3378 cm-1處出現(xiàn)的寬峰主要為水及醇、酚羥基的伸縮振動(dòng)吸收峰。由于蘆丁帶有多個(gè)羥基，生成配合物時(shí)對(duì)此峰基本無(wú)影響［8］。蘆丁在1655.36 cm-1處出現(xiàn)的羰基伸縮振動(dòng)吸收峰，在蘆丁-釤配合物中，該峰向低波數(shù)區(qū)位移到1624.51 cm-1處，向低波數(shù)位移了30 cm-1，這說(shuō)明羰基參與了配位反應(yīng)［9］，配位作用使C=O鍵減弱，相應(yīng)吸收峰向低波數(shù)位移。蘆丁-釤中苯環(huán)兀鍵共軛體系的C=C鍵伸縮振動(dòng)吸收峰，向低波數(shù)方向位移40 cm-1，是配位反應(yīng)對(duì)苯環(huán)共軛體系的影響所致。蘆丁在1362.31、1296.21 cm-1處的兩個(gè)譜峰是酚羥基的C-O鍵伸縮振動(dòng)與O-H鍵面內(nèi)變形振動(dòng)偶合所致。配合物中這兩個(gè)峰均出現(xiàn)在1355.22、1273.00 cm-1處，均向低波數(shù)方向位移分別為7.23 cm-1，說(shuō)明酚羥基參與了配位成鍵。配體在1203.99 cm-1到1168.78 cm-1處的吸收峰是醚的C-O-C伸縮振動(dòng)吸收峰，配合物中此峰基本保留在原來(lái)的位置，排除了醚氧原子成鍵的可能。

表1 蘆丁和蘆丁-釤的主要紅外吸收頻率Table 1 Principal characteristic IR absorption frequency of rutin and Rutin-Sm complex

2.1.2 紫外吸收光譜分析

圖2 蘆丁和蘆丁-釤配合物的紫外吸收光譜Fig.2 UV-VIS spectra of rutin and Rutin-Sm complex

由紫外吸收光譜分析的吸收數(shù)據(jù)可知，在蘆丁-釤中存在桂皮?；捅郊柞；?，因此有兩個(gè)主要的紫外吸收峰Ⅰ和Ⅱ，圖2所示。實(shí)驗(yàn)表明，形成稀土釤-蘆丁配合物后，帶Ⅰ、帶Ⅱ的吸收峰發(fā)生了紅移，兩者比較發(fā)現(xiàn)，蘆丁-釤配合物和蘆丁的紫外吸收峰的位置和強(qiáng)度均有改變，表明稀土離子和配體之間確有鍵合作用。

2.2 清除自由基活性

2.2.1 清除·OH自由基活性

按1.2.2方法，采用Fenton反應(yīng)生成羥基自由基，再與苯甲酸反應(yīng)，生成的羥基苯甲酸具有較強(qiáng)的熒光效率，可以通過(guò)測(cè)定羥基苯甲酸的生成速率間接測(cè)定羥基自由基的生成速率，其中Fenton反應(yīng)式為:Fe2++H2O2=Fe3++ ·OH+OH-。

如圖3所示，隨著加入蘆丁和蘆丁-釤濃度的增加，抑制率也隨之增加。蘆丁-釤配合物和蘆丁均具有清除·OH的能力，且配合物的清除能力強(qiáng)于蘆丁。

圖3 蘆丁及蘆丁釤配合物對(duì)羥基自由基(·OH)的抑制率Fig.3 Scavenging activities of rutin and Rutin-Sm complex on Hydroxyl radicalp

利用分光光度法測(cè)定鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物隨時(shí)間的變化曲線。按1.2.3實(shí)驗(yàn)方法分別測(cè)定蘆丁-釤配合物及蘆丁清除的能力。圖4所示，蘆丁-稀土釤配合物及蘆丁清除氧自由基的能力隨著含量的增大而增大，且配合物清除能力明顯強(qiáng)于蘆丁。

圖4 蘆丁及蘆丁釤配合物對(duì)超氧自由基)的抑制率Fig.4 Scavenging activities of rutin and Rutin-Sm complex on superoxide anion radical

2.2.3 清除DPPH·活性

DPPH·是一種較穩(wěn)定的自由基，在乙醇溶液中顯紫色，在吸收波長(zhǎng)517nm處吸收強(qiáng)度最大。當(dāng)自由基清除劑存在時(shí)，DPPH·的單電子配對(duì)，DPPH·濃度減小而使其顏色變淺，吸光度也減小。按1.2.4實(shí)驗(yàn)方法分別測(cè)定了蘆丁-釤配合物和蘆丁對(duì)DP PH·自由基的抑制作用，如圖5所示。且配合物清除DPPH·自由基的能力高于蘆丁。

圖5 蘆丁及蘆丁釤配合物對(duì)DPPH·自由基的消除率Fig.5 Scavenging activities of rutin and Rutin-Sm complex on DPPH·radical

2.3 抑菌能力分析

2.3.1 抑菌圈的測(cè)定:在無(wú)菌室中，將培養(yǎng)好的大腸桿菌菌種涂布于培養(yǎng)基表面，然后分別將用蒸餾水、DMSO、蘆丁和蘆丁-釤浸泡過(guò)的濾紙片放入不同的培養(yǎng)基中。在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后觀察。金黃色葡萄球菌的操作如同。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的大小。

表2 抑菌圈大小(d=mm)Table 2 Inhibition zone(d=mm)

由表2可知，蘆丁及蘆丁-稀土釤配合物能抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，由抑菌圈直徑可知配合物蘆丁-釤的抑菌活性強(qiáng)于蘆丁。

2.3.2 最低抑菌濃度的測(cè)定:將濃度為2.6 mg/mL的蘆丁溶液依次稀釋，將溶液用無(wú)菌吸量管取一定量加入培養(yǎng)基中涂勻培養(yǎng)基，用接種環(huán)將配置好的2種菌液分別接種于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)。蘆丁-釤的操作同上。用肉眼觀察完全沒(méi)有菌落生長(zhǎng)的最低溶液濃度作為最低抑菌濃度(MIC)。

表3 最低抑菌濃度的抑菌能力Table 3 Antibacterial activity of minimum inhibition concentration

“-”代表“不長(zhǎng)菌”;“+”代表“長(zhǎng)菌”?！?”means“no bacterium grow”;“+ ”means“have bacterium grow”.

由表3可知，蘆丁-釤配合物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度可達(dá)2.6×10-3mg/mL。在低濃度下所得稀土蘆丁配合物仍然具有明顯的抑菌活性，表明蘆丁-釤的抑菌活性強(qiáng)于蘆丁。

2.3.3 最低殺菌濃度的測(cè)定:從抑菌實(shí)驗(yàn)“不長(zhǎng)菌”培養(yǎng)基中，取出一定量培養(yǎng)物接種到不含其它樣品的培養(yǎng)基中，涂勻培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng)，少于5個(gè)菌落的為最低殺菌濃度(MBC)。

表4 最低殺菌濃度測(cè)定Table 4 Determination of Minimum bactericidal concentration

根據(jù)抑菌圈大小可以初步確定物質(zhì)的抑菌能力大小，抑菌圈直徑越大表明抑菌活性越高，表4可知蘆丁和蘆丁-釤配合物濃度較高時(shí)，具有強(qiáng)抑菌作用。且稀土蘆丁-釤配合物的抑菌效果明顯大于蘆丁，且對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性強(qiáng)于大腸桿菌的抑菌活性。原因可能是由于蘆丁和配合物與肽鏈和細(xì)胞磷脂上的羧基具有較強(qiáng)的親和力，可以與菌的轉(zhuǎn)移核糖核酸中的磷?；I合，抑制其核酸酶的活性以及功能，使細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制而達(dá)到抑菌效果;另由于蘆丁和釤形成配合物后，配合物的分子量變大，脂溶性隨之增強(qiáng)，同時(shí)對(duì)細(xì)胞膜的穿透力增強(qiáng)，使生物體生長(zhǎng)以及代謝需要的關(guān)鍵成分都流失，破壞生物體正常運(yùn)轉(zhuǎn)活動(dòng)［8］，蘆丁和蘆丁-釤配合物的抑菌效果就是由于此原因而體現(xiàn)出來(lái)。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)選用菌種革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)、革蘭氏陰性菌(金黃色葡萄球菌)進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，稀土釤蘆丁配合物的抑菌效果隨配合物濃度的增加，抑菌活性顯著增大，最低抑菌濃度可達(dá)2.6×10-3mg/mL。通過(guò)熒光動(dòng)力學(xué)曲線發(fā)現(xiàn)蘆丁和蘆丁-釤配合物對(duì)DPPH·自由基、·OH自由基及O-·2自由基均有一定的清除能力。

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