肉桂水溶性部位中一個(gè)新的順式肉桂酸苷衍生物

羅 奇，程 霞，晏永明，程永現(xiàn)，*

1大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，大理 671002;2中國科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650204

肉桂(Cinnamomum cassia)為樟科(Lauraceae)樟屬植物肉桂的干皮，是常用溫里中藥，具有芳香開竅、祛風(fēng)健胃、抗?jié)?、?qiáng)心、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解熱、抗驚厥、抑制血小板聚集和抗病原體等作用［1］。近年，隨著中醫(yī)溫陽學(xué)術(shù)思想倍受推崇，溫性中藥肉桂的臨床應(yīng)用也在增加。肉桂也是一種常用的辛香調(diào)料，用于煮肉和制作多種食品，在美國，作為調(diào)味品的肉桂其銷量已占據(jù)第二重要位置。我們關(guān)注糖尿病腎病，并從糖尿病腎病屬于微血管病變的病理認(rèn)為溫性中藥可能對(duì)其防治是有效的，為此，我們對(duì)肉桂中成分及其抗糖尿病腎病作用進(jìn)行了研究。采用各種柱色譜從其80%乙醇提取物的水溶性部位分離得到10個(gè)化合物，除化合物3、6和10外，其它化合物均系首次從該種中首次分離。

1 儀器與材料

JASCO-20C型數(shù)字式旋光儀(日本);VG AUTO Spec-3000(英國 VG公司)及Finnigan MAT 90質(zhì)譜儀(德國 Finnigan公司);Bruker AM-400、DRX-500及Avance III 600 MHz核磁共振儀(TMS作為內(nèi)標(biāo)，δ為ppm，J為Hz);200～300目柱色譜用硅膠和GF254薄層色譜用硅膠(青島海洋化工廠);45～75 μm MCI gel CHP 20P(日本三菱公司產(chǎn)品);25～100 μm Sephadex LH-20(Pharmacia公司);40 ～63 μm RP-18(日本 Daiso);Agilent RP-18 HPLC色譜柱(9.4 mm × 250 mm，5 μm);Agilent RP-18 HPLC 色譜柱(6 mm × 150 mm，5 μm)。氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等有機(jī)溶劑均為工業(yè)純經(jīng)重蒸后使用，去離子水，異丙醇(分析純)。

肉桂樣品于2010年7月購自云南向輝生物科技有限公司，由向輝生物科技有限公司謝福壽工程師鑒定。標(biāo)本(CHYX0173)存于中國科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 提取與分離

干燥肉桂50 kg，粉碎，80%乙醇160 L冷浸動(dòng)態(tài)提取3次，過濾，減壓回收乙醇得浸膏(I)7.5 kg。隨后將浸膏(I)用丙酮溶解，過濾，減壓回收丙酮得浸膏(II)5.0 kg。浸膏(II)加水懸浮后依次用石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，濃縮水層得到1.5 kg，通過類似切割柱的方法(20 ×120 cm，7.5 kg，硅膠200～300 目)，以氯仿-甲醇-水(80∶20∶2.5，25 L，v/v)洗脫劃分三段(Fr.1～Fr.3)。各組份經(jīng)MCI gel CHP 20P、Sephadex LH-20(甲醇)、RP-18 反復(fù)柱層析，反相HPLC，結(jié)合制備TLC從Fr.1中獲得3(1.4 mg)、4(1.3 mg);Fr.2 中獲得 6(4.7 mg)、7(2.0 mg)、8(1.5 mg)和9(1.8 mg);Fr.3中獲得1(3.2 mg)、2(1.7 mg)、5(4.1 mg)和10(2.2 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

Cassoside I(1)無色油狀物。［α］25D:-43.0(c 1.6，MeOH);UV(MeOH)λmax(logε):315(3.94)，292(3.95)，202(4.05)nm;EI-MS:m/z 370［M］+;HREI-MS:m/z 370.1229［M］+(calcd for C17H22O9，370.1264);1H NMR(600 MHz，CD3OD) δ:7.77(1H，d，J=1.9 Hz，H-2)，7.13(1H，overlapped，H-5)，7.17(1H，overlapped，H-6)，6.91(1H，d，J=12.9 Hz，H-7)，5.88(1H，d，J=12.9 Hz，H-8)，4.97(1H，d，J=7.4 Hz，H-1')，3.53(1H，overlapped，H-2')，3.48(1H，overlapped，H-3')，3.41-3.43(2H，overlapped，H-4'，H-5')，3.88(1H，overlapped，H-6'a)，3.69(1H，dd，J=12.0 Hz，5.5 Hz，H-6'b)，3.88(3H，overlapped，-OCH3)，3.72(3H，s，-COOCH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:130.8(C-1)，115.3(C-2)，150.1(C-3)，149.0(C-4)，116.4(C-5)，125.8(C-6)，144.6(C-7)，118.1(C-8)，168.5(C-9)，102.1(C-1')，74.7(C-2')，78.2(C-3')，71.2(C-4')，77.8(C-5')，62.4(C-6')，56.6(-OCH3)，52.1(-COOCH3)。

化合物1中混有化合物2，利用反相HPLC純化化合物1后，在進(jìn)行核磁共振測(cè)試時(shí)，發(fā)現(xiàn)化合物1中含有化合物2，其比例接近2∶1，據(jù)此推測(cè)化合物2很可能是化合物1不穩(wěn)定造成的。從1H NMR和13C NMR譜可以看出信號(hào)成對(duì)存在?；衔?的1H NMR 給出7.64(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)和6.42(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)，表明存在反式雙鍵結(jié)構(gòu)。主要含有化合物1的樣品的1H NMR譜給出6.91(1H，d，J=12.9 Hz，H-7)和 5.88(1H，d，J=12.9 Hz，H-8)，表明化合物1中存在順式雙鍵結(jié)構(gòu)，其它數(shù)據(jù)與化合物2基本一致，因此化合物1可被鑒定為Glucosyl methyl ferulate(2)的順式異構(gòu)體，該化合物為新化合物，命名為Cassoside I?；衔?的主要HMBC和COSY相關(guān)見圖1，化合物1與2的HPLC圖譜見圖2。

圖1 化合物1的主要COSY及HMBC相關(guān)Fig.1 Key HMBC and COSY correlations of compound 1

圖2 化合物1(A)、化合物1核磁樣品(B)及化合物2(C)的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of purified compound 1(A)，compound 1 degraded sample(B)and purified compound 2(C)

Glucosyl methyl ferulate(2)無色油狀物。［α］:-59.5(c 1.5，MeOH);UV(MeOH)λmax(logε):315(4.01)，293(4.03)，202(4.10)nm;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.22(1H，d，J=1.3 Hz，H-2)，7.13(1H，overlapped，H-5)，7.17(1H，overlapped，H-6)，7.64(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)，6.42(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)，4.97(1H，d，J=7.4 Hz，H-1')，3.53(1H，dd，J=8.9，7.4 Hz，H-2')，3.48(1H，dd，J=8.9，8.9 Hz，H-3')，3.41-3.43(2H，overlapped，H-4'，H-5')，3.89(1H，dd，J=12.0 Hz，2.0 Hz，H-6'a)，3.70(1H，dd，J=12.0，5.5 Hz，H-6'b)，3.90(3H，s，-OCH3)，3.78(3H，s，-COOCH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:130.4(C-1)，112.4(C-2)，150.8(C-3)，49.9(C-4)，117.3(C-5)，123.4(C-6)，145.9(C-7)，117.1(C-8)，169.2(C-9)，102.1(C-1')，74.7(C-2')，78.2(C-3')，71.2(C-4')，77.8(C-5')，62.4(C-6')，56.6(-OCH3)，52.1(-COOCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值相符［2］。

Caffeine(3)白色粉末。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:3.35(3H，s，N1-CH3)，3.53(3H，s，N3-CH3)，3.98(3H，s，N7-CH3)，7.87(1H，s，H-8);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:28.3(N1-CH3)，156.8(C-2)，30.2(N3-CH3)，150.0(C-4)，109.0(C-5)，153.4(C-6)，34.1(N7-CH3)，144.1(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值相符［3］。

3-Hydroxy-4-methoxy-phenylethanol(4)淡黃色油狀物。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:6.73(1H，d，J=1.7 Hz，H-2)，6.63(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.57(1H，dd，J=8.0，1.8 Hz，H-6)，2.66(2H，t，J=7.2 Hz，H-7)，3.63(2H，t，J=7.2 Hz，H-8)，3.28(3H，s，-OCH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:131.7(C-1)，116.0(C-2)，145.8(C-3)，148.8(C-4)，113.5(C-5)，122.3(C-6)，39.8(C-7)，64.5(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值相符［4］。

Glycerol-2-(3-methoxy-4-hydroxybenzoic acid)ether(5)無色針晶。1H NMR(600 MHz，Pyr-d5)δ:7.75(1H，d，J=1.8 Hz，H-2)，7.44(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，7.84(1H，dd，J=8.4，1.8 Hz，H-6)，6.89(2H，brs，2(OH)，4.40(2H，dd，J=10.6，5.5 Hz，H-1'a，H-3'a)，4.36(2H，dd，J=10.6，5.5 Hz，H-1'b，H-3'b)，5.07(1H，m，H-2')，3.69(3H，s，-OCH3);13C NMR(150 MHz，Pyr-d5)δ:123.2(C-1，C-6)，113.5(C-2)，149.8(C-3)，153.5(C-4)，114.7(C-5)，167.3(-COOH)，62.0(C-1'，C-3')，82.6(C-2')，55.9(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值相符［5］。

Cinnacaside(6)淡黃色油狀物。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ:4.04(1H，d，J=10.2 Hz，H-1)，1.76-1.80(1H，m，H-2)，1.53-1.59(2H，m，H-3)，1.51-1.55(2H，m，H-4)，2.45(2H，d，J=3.3 Hz，H-10)，2.66(1H，d，J=12.7 Hz，H-14a)，2.18(1H，d，J=12.7 Hz，H-14b)，1.09(3H，d，J=6.3 Hz，H-15)，1.04(3H，s，H-16)，1.78(3H，s，H-17)，2.88-2.92(1H，m，H-18)，3.86(1H，overlapped，H-19a)，3.44-3.48(1H，t，J=9.0 Hz，H-19b)，0.95(3H，d，J=6.9 Hz，H-20)，4.24(1H，d，J=7.8 Hz，H-1')，3.14-3.19(1H，m，H-2')，3.25-3.36(1H，overlapped，H-3')，3.25-3.36(1H，overlapped，H-4')，3.25-3.36(1H，overlapped，H-5')，3.66(1H，dd，J=3.6，11.7 Hz，H-6'a)，3.86(1H，m，H-6'b);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ:72.9(C-1)，35.1(C-2)，28.9(C-3)，26.5(C-4)，84.6(C-5)，93.0(C-6)，96.9(C-7)，89.3(C-8)，48.3(C-9)，40.8(C-10)，171.7(C-11)，137.3(C-12)，143.1(C-13)，37.2(C-14)，18.9(C-15)，13.7(C-16)，12.3(C-17)，34.4(C-18)，73.7(C-19)，14.9(C-20)，104.5(C-1')，75.2(C-2')，78.0(C-3')，71.7(C-4')，78.1(C-5')，62.8(C-6')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值相符［6］。

阿魏酸甲酯(7)白色粉末。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.09(1H，s，H-2)，6.98(1H，dd，J=8.1，1.6 Hz，H-5)，6.68(1H，dd，J=8.1，1.6 Hz，H-6)，7.53(1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，6.26(1H，d，J=15.9 Hz，H-8)，3.80(3H，s，-OCH3)，3.68(3H，s，-OCH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:126.8(C-1)，124.4(C-2)，152.0(C-3)，149.7(C-4)，116.7(C-5)，114.4(C-6)，147.1(C-7)，111.3(C-8)，169.9(C-9)，56.3(-OCH3)，51.9(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值相符［7］。

Methyl p-hydroxy-trans-cinnamate(8)白色粉末。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.36(2H，d，J=9.1 Hz，H-2，H-6)，6.70(2H，d，J=9.1 Hz，H-3，H-5)，7.53(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)，6.23(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)，3.68(3H，s，-OCH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:126.5(C-1)，131.2(C-2，C-6)，117.4(C-3，C-5)，162.3(C-4)，146.7(C-7)，114.3(C-8)，169.8(C-9)，51.9(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值相符［8］。

Methyl p-hydroxy-cis-cinnamate(9)白色粉末。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.56(2H，d，J=9.1 Hz，H-2，H-6)，6.66(2H，d，J=9.1 Hz，H-3，H-5)，6.77(1H，d，J=12.8 Hz，H-7)，5.68(1H，d，J=12.8 Hz，H-8)，3.62(3H，s，-OCH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:127.1(C-1)，133.7(C-2，C-6)，116.1(C-3，C-5)，161.1(C-4)，145.3(C-7)，115.6(C-8)，169.6(C-9)，51.9(-OCH3)?；衔?8的1H NMR 信號(hào)中，7.53(1H，d，J=16.0 Hz，H-3)和6.23(1H，d，J=16.0 Hz，H-2)為反式偶合烯氫質(zhì)子信號(hào)。化合物9的1H NMR信號(hào)中，6.77(1H，d，J=12.8 Hz，H-3)和5.68(1H，d，J=12.8 Hz，H-2)為典型的順式偶合烯氫質(zhì)子信號(hào)，13C NMR信號(hào)與化合物8基本一致。故鑒定化合物9為Methyl p-hydroxy-cis-cinnamate［9，10］。

(+)-Lyoniresinol 3a-O-β-D-glucopyranoside(10)淡黃色油狀物。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:2.65(1H，dd，J=14.9，5.4 Hz，H-1a)，2.55(1H，dd，J=14.9，5.4 Hz，H-1b)，1.69-1.59(1H，m，H-2)，2.04-1.96(1H，m，H-3)，3.83(1H，dd，J=9.8，5.4Hz，H-4)，6.51(1H，s，H-8)，6.36(2H，s，H-2'，H-6')，4.35(1H，d，J=6.6 Hz，H-2a)，4.21(1H，d，J=6.6 Hz，H-2b)，3.48(1H，dd，J=10.9，6.6 Hz，H-3a)，3.38(1H，dd，J=10.9，6.6 Hz，H-3b)，3.79(3H，s，OCH3)，3.68(6H，s，2 × OCH3)，3.26(3H，s，OCH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:33.9(C-1)，40.5(C-2)，66.2(C-2a)，46.7(C-3)，71.4(C-3a)，42.8(C-4)，148.6(C-5)，138.9(C-6)，147.6(C-7)，107.8(C-8)，130.2(C-9)，126.4(C-10)，139.4(C-1')，106.8(C-2')，149.0(C-3')，134.4(C-4')，149.0(C-5')，106.8(C-6')，104.9(C-1”)，75.2(C-2”)，78.0(C-3”)，71.7(C-4”)，78.2(C-5”)，62.8(C-6”)，60.3(5-OCH3)，56.5(7-OCH3)，56.8(3'-OCH3)，56.8(5'-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值相符［11］。

4 活性測(cè)試

肉桂為溫里中藥，依據(jù)中醫(yī)理論其可能對(duì)糖尿病腎病具有干預(yù)作用。為此本實(shí)驗(yàn)對(duì)所有分離的化合物進(jìn)行了抗糖尿病腎病活性測(cè)試。高糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞可分泌促炎性因子和細(xì)胞外基質(zhì)等，類似臨床糖尿病腎病病理，因此被認(rèn)為是研究抗糖尿病腎病的常用模型。采用文獻(xiàn)報(bào)道的ELISA法測(cè)定大鼠腎系膜細(xì)胞(HBZY-1)培養(yǎng)上清中的IL-6、fibronectin 及 collagen IV 表達(dá)水平［12，13］。用純化的抗IL-6、fibronectin及collagen IV抗體包被微孔板，制成固相抗體，向包被單抗的微孔中依次加入含表達(dá)IL-6、fibronectin及collagen IV的待測(cè)樣品，再與HRP標(biāo)記的抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 IL-6、fibronectin及collagen IV的表達(dá)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠 IL-6、fibronectin及collagen IV濃度。遺憾的是，結(jié)果表明這些成分對(duì)上述細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)均未顯示明顯的活性，是否肉桂中其它成分具有抗糖尿病腎病作用有待進(jìn)一步研究。

致謝:中國科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分析中心測(cè)試所有圖譜。

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