油菜蜂花粉超臨界提取物HPLC-FLD分析及體外清除自由基活性研究

呂歡歡，王小艷 ，王洪倫，索有瑞

1中國科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧810001;2中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

青藏高原平均海拔3000 m以上，高寒、缺氧、晝夜溫差大、日照時間長、紫外線輻射強(qiáng)、植物病蟲害少等，獨(dú)特的地理條件和高原氣候，十分有利于蜜源植物的生長。青藏高原每年油菜蜂花粉產(chǎn)量約800～1000噸。油菜蜂花粉具有多種生物活性，可用于延緩衰老［1］、治療和預(yù)防癌癥［2］、調(diào)節(jié)免疫功能［3］、降血脂［4］、抗炎抗過敏［5］、抗氧化［6］等。

近年來，由于超臨界CO2提取技術(shù)低溫、無毒、無污染、無溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)的顯現(xiàn)，該提取技術(shù)已逐漸規(guī)?；貞?yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)室通過超臨界設(shè)備提取獲得的油菜蜂花粉超臨界提取物(rape bee pollen supercritical fluid extract，PSFE)主要以油脂的形式存在，其中主要含有脂肪酸。最常見的脂肪酸分析方法是GC-MS法，該方法成本低、速度快，但缺點(diǎn)是靈敏度欠佳、穩(wěn)定性差、衍生重現(xiàn)性不夠理想等。為了明確PSFE提取物中的主要成分及含量，本文采用本實(shí)驗(yàn)室自行合成的1，2-苯并-3，4-二氫咔唑-9-乙基對甲苯磺酸酯(BDETS)［7］作為柱前衍生化試劑，利用柱前衍生-高效液相色譜-熒光檢測(HPLC-FLD)法對PSFE提取物進(jìn)行了成分分析和測定。該方法具有較高的靈敏度。同時，本文對PSFE提取物分別進(jìn)行了羥基自由基、超氧陰離子自由基和二苯代苦味酰基自由基體外清除效果的考察，以期為青藏高原油菜蜂花粉資源的高附加值開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油菜蜂花粉產(chǎn)自青海省海北州門源縣，由青海友林科技發(fā)展有限公司提供。將蜂花粉干燥、除雜后，粉碎至粒度為0.6 mm左右作為提取材料。

1，2-苯并-3，4-二氫咔唑-9-乙基對甲苯磺酸酯(BDETS，自制);30種飽和脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品(上海試劑廠);9種不飽和脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司);色譜純乙腈(ACN，德國 Merck公司);碳酸鉀、氫氧化鉀、鹽酸、硫酸(分析純，西安化學(xué)試劑廠);甲醇(色譜純，山東禹城化學(xué)試劑廠);N，N-二甲基甲酰胺(DMF)經(jīng)減壓蒸餾后使用;二苯代苦味?；杂苫?Sigma公司);鄰二氮菲(上海中秦化學(xué)試劑有限公司);L-抗壞血酸(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司);Tris(成都化學(xué)試劑廠);鄰苯三酚、雙氧水、無水乙醇、七水合硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、石油醚(沸程60～90℃)、乙酸乙酯、磷酸氫二鈉、DMSO均為國產(chǎn)分析純;純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100型高效液相色譜(Agilent公司)配備四元梯度泵，在線真空脫氣機(jī)，655-10S型熒光檢測器，100位自動進(jìn)樣器;CARY300Bio型紫外-可見分光光度計(美國Varian公司);HA221-50-06超臨界CO2萃取裝置(南通儀創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);CO2純度為99.99%(西寧大通二氧化碳廠);ALC-1104電子天平(德國Sartorius公司);HH-4恒溫水浴鍋(國華電器有限公司);電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);9FZ-19型齒爪式粉碎機(jī)(四川省永興機(jī)械廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備及其衍生過程

準(zhǔn)確取定量脂肪酸標(biāo)品，用色譜純乙腈配成1.0×10-2mol/L的溶液。稱取8.32 mg BDETS，用DMF定容至10 mL，濃度為1.0×10-2mol/L。相應(yīng)低濃度的脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)液(1.0×10-4mol/L)用色譜純乙腈稀釋而成。向盛有10 mg無水K2CO3催化劑的 1.5 mL 安培瓶中依次加入 400 μL DMF、100 μL混合脂肪酸(1.0×10-4mol/L)、200 μL BDETS溶液，封口后于90℃水浴下振蕩反應(yīng)30 min，放冷后，取出200 μL衍生液加200 μL色譜純乙腈溶液稀釋2倍后搖勻，進(jìn)樣10 μL分析。

1.3.2 HPLC-FLD分析條件

色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C8色譜柱(4.6(150 mm，5 μm)。流動相 A:50%乙腈(色譜純);流動相B:100%乙腈(色譜純);流動相D:乙腈/N，N-二甲基甲酰胺 =2/1(v/v)。流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為30℃。梯度洗脫程序如下:0～20 min，100% ～60%A，0～40%B;20～20.2 min，60 ～45%A，40 ～55%B;20.2 ～40 min，45 ～15%A，55 ～85%B;40 ～60 min，15～0%A，85～100%B;60 ～65 min，100%B;65 ～65.2 min，100～0%B，0～100%D;65.2～85 min，100%D。熒光檢測的激發(fā)波長為λex=333 nm，發(fā)射波長為λem=390 nm。

1.3.3 PSFE樣品及各供試液的制備

取經(jīng)前處理后的油菜蜂花粉裝填于超臨界CO2萃取裝置的萃取釜中，設(shè)定萃取釜的萃取條件為:溫度45 ℃、壓力35 MPa、時間90 min、CO2流量40 kg/h。設(shè)定分離釜I的條件為:溫度30℃、壓力7.0 MPa;分離釜 II的條件為:溫度30℃、壓力 5.3 MPa。經(jīng)上述條件萃取得到油菜蜂花粉超臨界提取物(PSFE)。

稱取0.1 g PSFE提取物(精確到0.0001)，加入3.0 mL DMF后超聲搖勻。向盛有10 mg無水K2CO3催化劑的安培瓶中依次加入200 μL DMF，150 μL PSFE 樣品溶液，100 μL BDETS 衍生試劑(0.01 mol/L)，封口后于90℃水浴下振蕩反應(yīng)30 min，取100 μL衍生液加入300 μL色譜純乙腈稀釋4倍后搖勻，取10 μL進(jìn)樣，做 HPLC-FLD成分分析。

稱取適量的PSFE提取物，用石油醚∶無水乙醇=1∶1(v/v)的溶劑系統(tǒng)溶解得到母液。然后稀釋配成2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL 5 個濃度梯度的樣品溶液，作為體外清除自由基實(shí)驗(yàn)的供試液(配置同濃度L-抗壞血酸作陽性對照)。

1.3.4 超氧陰離子自由基清除能力測定［8］

采用鄰苯三酚自氧化法。取25℃水浴中預(yù)熱20 min的5.0×10-2mol/L pH 8.2的 Tris-HCl緩沖液4.5 mL，依次加入1 mL不同濃度的樣品溶液(或蒸餾水)及0.4 mL 2.5×10-2mol/L鄰苯三酚溶液，立即混勻置25℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，然后加入8 mol/L的HCl 1.0 mL終止反應(yīng)。以Tris-HCl緩沖液作參比，于實(shí)驗(yàn)掃描確定的最大吸收波長處測定其吸光度。每個處理均做三個重復(fù)，并以同濃度L-抗壞血酸作為陽性對照。對的清除率按如下公式計算:

式中，A1:Tris-HCl緩沖液4.5 mL加蒸餾水1 mL加鄰苯三酚溶液0.4 mL;A2:以1.0×10-2mol/L鹽酸代替A1中的鄰苯三酚;A3:以樣品溶液代替A1中的蒸餾水;A4:以1.0×10-2mol/L鹽酸代替A3中的鄰苯三酚。

1.3.5 DPPH自由基清除能力測定［9］

取0.2 mL原溶劑加入7.8 mL濃度為2.5×10-3mg/mL DPPH·甲醇溶液，立即混勻，避光室溫放置30 min，以原溶劑調(diào)零，于實(shí)驗(yàn)掃描確定的最大吸收波長處測定其吸光度，得A0值;以不同濃度的樣品溶液代替A0中的0.2 mL原溶劑，測吸光度得Ai值;以原溶劑代替Ai中的7.8 mL DPPH·溶液，測吸光度得Aj值。每個處理均做三個重復(fù)，并以同濃度L-抗壞血酸作陽性對照。按下式計算(DPPH·)的清除率:

圖1 標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸衍生物(A)及油菜蜂花粉超臨界提取物(B)的色譜分離圖Fig.1 HPLC-FLD chromatograms of standard fatty acid derivatives(A)and fatty acid derivatives of rape bee pollen supercritical fluid extract(B)

1.3.6 羥基自由基清除能力測定［10］

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法。取7.5×10-4mol/L鄰二氮菲溶液1 mL于試管中，依次加入0.2×10-3mol/mL(pH=7.4)的磷酸鹽緩沖液2 mL和蒸餾水1 mL，充分混勻后，加入7.5×10-4mol/L硫酸亞鐵溶液1 mL，混勻再加1 mL 0.01%H2O2后在37℃下水浴反應(yīng)60 min，于實(shí)驗(yàn)掃描確定的最大吸收波長處測定其吸光度，得AP值;將上述方法中的H2O2用1 mL蒸餾水代替，測吸光度得Ab值;用樣品溶液代替1 mL蒸餾水，測吸光度得AS值。同時分別對每個樣品做本底組，每個處理均做三個重復(fù)，并以同質(zhì)量濃度的L-抗壞血酸作為陽性對照。對·OH的清除率按如下公式計算:

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC-FLD色譜分離

如圖1(A)所示，39種標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸衍生物獲得良好的基線分離。其中，本實(shí)驗(yàn)在流動相D中添加了溶解能力極強(qiáng)的DMF，可以使難以洗脫的高碳長鏈脂肪酸實(shí)現(xiàn)快速洗脫，避免過長的分離時間。

2.2 PSFE樣品HPLC-FLD分析及含量測定

按上述實(shí)驗(yàn)條件，對脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品衍生后進(jìn)行了HPLC-FLD分析測定，依據(jù)峰面積和實(shí)際進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸，得到各標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸衍生物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限，見下表1。各種脂肪酸的檢測限為6.05～98.86 fmol，各種脂肪酸的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9989。以相同的實(shí)驗(yàn)條件，對PSFE提取物衍生后進(jìn)行了HPLC-FLD分析測定，色譜分離圖見圖1(B)，樣品中各類脂肪酸的種類及含量見表1。結(jié)果表明，PSFE提取物中含有豐富的游離脂肪酸，其中飽和脂肪酸占總游離脂肪酸的58%，不飽和脂肪酸占總游離脂肪酸的42%。PSFE提取物中含量較高的不飽和脂肪酸種類主要是C18∶3、C18∶2和 C18∶1，其中 C18∶3的含量最高，達(dá)到了10933.69 μg/g。PSFE提取物中含量較高的飽和脂肪酸為C16，含量達(dá)到了4116.436 μg/g。

表1 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限及PSFE樣品中脂肪酸的含量Table 1 Linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and fatty acids contents of PSFE

a:回歸方程Y=AX+B，Y:峰面積;X:進(jìn)樣量(pmol)。a:In the regression equation Y=AX+B，Y refers to the peak area，X refers to the injection amount(pmol).

2.3 PSFE樣品對超氧陰離子自由基的清除作用

實(shí)驗(yàn)首先對鄰苯三酚自氧化中間產(chǎn)物的吸收波長進(jìn)行了掃描測定。由圖2可知，鄰苯三酚自氧化中間產(chǎn)物在波長268 nm和299 nm兩處分別有特征吸收峰，當(dāng)加入實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的L-抗壞血酸后，在299 nm處的吸收峰明顯降低，而268 nm處的吸收峰基本不變，因此，本實(shí)驗(yàn)確定該超氧陰離子自由基體系的檢測波長為299 nm。

圖2 鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物最大紫外吸收光譜及L-抗壞血酸清除的光譜Fig.2 UV absorption spectra of pyrogallol autoxidation product and L-ascorbic on scavenging

圖3 PSFE及L-抗壞血酸對的清除作用Fig.3 The scavenging effects of PSFE and L-ascorbic acid on

2.4 PSFE樣品對DPPH自由基的清除作用

由圖4可知，經(jīng)掃描測定發(fā)現(xiàn)DPPH·甲醇溶液在320 nm和515 nm處分別有兩個特征吸收峰，當(dāng)加入實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的L-抗壞血酸溶液后，其位于515 nm處的吸收峰明顯降低，因此，本實(shí)驗(yàn)確定用515 nm作為測定DPPH·含量變化的檢測波長。

圖4 DPPH·的吸收光譜和L-抗壞血酸清除DPPH·的吸收光譜Fig.4 UV absorption spectra of DPPH·and L-ascorbic on scavenging DPPH·

由圖5可知，在實(shí)驗(yàn)濃度2.0～10.0 mg/mL的范圍內(nèi)，陽性對照物L(fēng)-抗壞血酸對DPPH·的清除率變化不大，保持在50%上下。而PSFE樣品對DPPH·的清除作用隨著其樣品濃度的增大而逐漸升高，達(dá)到60%以上，高于陽性對照。

圖6 鄰二氮菲-Fe2+的吸收光譜和 L-抗壞血酸清除·OH的吸收光譜Fig.6 UV absorption spectra of 1，10-Phenanthroline monohydrate-Fe2+and L-ascorbic on scavenging·OH

2.5 PSFE樣品對羥基自由基的清除作用

由圖6可見，經(jīng)實(shí)驗(yàn)掃描發(fā)現(xiàn)鄰二氮菲-Fe2+反應(yīng)液在510 nm處有最大吸收峰，當(dāng)加入實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的陽性對照物L(fēng)-抗壞血酸后，由于抑制了雙氧水與鄰二氮菲-Fe2+發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生·OH，因而在一定程度上使得鄰二氮菲-Fe2+反應(yīng)液產(chǎn)生的最大吸收峰降低或甚至消失，因此，本實(shí)驗(yàn)確定以510 nm作為各反應(yīng)液的檢測波長。

PSFE樣品及L-抗壞血酸對·OH的清除效果由圖7可知，在實(shí)驗(yàn)濃度0.2～1.0 mg/mL的范圍內(nèi)，PSFE對·OH有一定清除效果，且其清除能力隨著樣品濃度的逐漸增加而略有增大。但與L-抗壞血酸相比，其清除效果不強(qiáng)。據(jù)有關(guān)研究報道，·OH是所有氧自由基中最活潑的，許多自由基清除劑即使能夠清除，但是卻不能清除·OH。這個結(jié)論在一定程度上有可能解釋PSFE對·OH的清除效果不顯著的原因。

圖7 PSFE及L-抗壞血酸對羥自由基的清除作用Fig.7 The scavenging effects of PSFE and L-ascorbic acid on·OH

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用 1，2-苯并-3，4-二氫咔唑-9-乙基對甲苯磺酸酯作為柱前熒光衍生試劑，通過HPLCFLD法對青藏高原油菜蜂花粉超臨界提取物中的主要成分游離脂肪酸進(jìn)行了定性和定量分析。結(jié)果表明，各種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的檢測限為6.05～98.86 fmol，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9989。PSFE提取物中含有豐富的游離脂肪酸，其中飽和脂肪酸占總游離脂肪酸的58%，不飽和脂肪酸占總游離脂肪酸的42%。PSFE提取物中含量較高的不飽和脂肪酸種類主要是 C18∶3、C18∶2 和 C18∶1，其中 C18∶3 的含量最高，達(dá)到了 10933.69 μg/g。

同時，本實(shí)驗(yàn)對PSFE的體外清除自由基效果考察結(jié)果表明:該超臨界提取物PSFE對DPPH自由基表現(xiàn)出很高的清除能力且呈量效關(guān)系，即在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)其清除率最高可達(dá)60.29%，高于陽性對照物;而對于羥基自由基和超氧陰離子自由基，該超臨界提取物也表現(xiàn)出不同程度的清除能力，即在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)其最高清除率分別為7.59%和11.99%。據(jù)報道，新鮮的蜂花粉抗氧化活性最高，其后隨著貯存年頭的增加其抗氧化能力減小，經(jīng)過3年以上貯存后其抗氧化活性會減少50%。本實(shí)驗(yàn)所用材料為自然貯存兩年的油菜蜂花粉，其超臨界提取物的自由基清除能力是否比當(dāng)年采收的蜂花粉有所降低，還有待進(jìn)一步研究。

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