血管生成素4對脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響*

李 巖, 馬明明, 張小強(qiáng), 潘雯菲, 劉向勇, 王曉芝△

(1濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東 濱州 256603； 2德州市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東 德州 253014； 3濱州醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，山東 煙臺 264003)

血管生成素4對脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響*

李 巖1, 馬明明1, 張小強(qiáng)2, 潘雯菲3, 劉向勇3, 王曉芝1△

(1濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東 濱州 256603；2德州市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東 德州 253014；3濱州醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，山東 煙臺 264003)

目的觀察血管生成素4(Ang-4)對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)損傷的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法EnVision法免疫組化鑒定HUVECs。LPS誘導(dǎo)細(xì)胞損傷,不同劑量的Ang-4干預(yù)。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測細(xì)胞活力，ELISA法檢測von Willebrand因子(vWF)和腫瘤壞死因子(TNF-α)含量，real-time PCR檢測Toll樣受體4(TLR4)、核因子κB(NF-κB) p65和TNF-α mRNA含量變化。結(jié)果免疫組化示胞漿內(nèi)人Ⅷ因子相關(guān)抗原呈陽性；與正常組比，LPS組細(xì)胞增殖活力降低(P<0.01)，vWF及TNF-α分泌增多(P<0.01)，且TLR4、NF-κB p65和TNF-α mRNA表達(dá)升高(P<0.01)；Ang-4(100 μg/L)組可恢復(fù)細(xì)胞活力，降低vWF及TNF-α含量(P<0.01)，抑制LPS所致TLR4、NF-κB p65和TNF-α mRNA的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論Ang-4可拮抗LPS誘導(dǎo)的HUVECs損傷，這可能與抑制TLR4-NF-κB p65-TNF-α信號通路的活化有關(guān)。

血管生成素4； 脂多糖類； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； von Willebrand因子

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種急性低氧性呼吸功能不全，進(jìn)一步發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病死率高達(dá)50%。目前認(rèn)為持續(xù)的內(nèi)皮細(xì)胞激活并受損、血管高通透性及血管滲漏是ALI/ARDS發(fā)病的關(guān)鍵。血管生成素(angiopoietin，Ang)家族是近年來新發(fā)現(xiàn)的由血管內(nèi)皮周圍細(xì)胞分泌的一種通過作用于細(xì)胞膜上的酪氨酸激酶受體Tie-2發(fā)揮生物學(xué)作用的內(nèi)皮細(xì)胞特異性促血管生成因子。Ang-4是Valenzuela等[1]發(fā)現(xiàn)的人胎盤分離到的一種分泌蛋白。本文旨在探索Ang-4對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)損傷的影響及其可能的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

HUVECs由本實驗室提供；Ang-4購自R&D；鼠抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原多克隆抗體及Ⅱ抗羊抗鼠IgG H&L均購自Abcam； LPS購自Sigma；檢測von Willeband因子(von Willebrand factor，vWF)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)的ELISA試劑盒購自上海太陽生物有限公司；real-time PCR引物均由上海生工生物有限公司設(shè)計。

2方法

2.1HUVECs培養(yǎng) HUVECs用含雙抗及含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞長到80%融合時傳代。

2.2HUVECs形態(tài)學(xué)觀察及鑒定 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長特征。人Ⅷ因子相關(guān)抗原鑒定采用EnVision法，以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表現(xiàn)。

2.3實驗分組及處理 (1)對照組：不加任何處理因素；(2)LPS組：加入LPS(10 mg/L);(3)Ang-4組: Ang-4(10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L和200 μg/L)預(yù)處理0.5 h，加入LPS 10 mg/L共培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下拍照。

2.4MTT法檢測LPS及Ang-4對細(xì)胞增殖活力的影響 參照說明書操作。細(xì)胞抑制率(%)=1-實驗組A492/對照組A492×100%。

2.5ELISA法檢測vWF及TNF-α含量 將細(xì)胞接種于24孔板，設(shè)正常對照組、10 mg/L LPS刺激組和100 μg/L Ang-4干預(yù)組，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞上清液及細(xì)胞裂解液。按ELISA試劑盒說明書操作。

2.6Real-time PCR檢測Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB) p65和TNF-α mRNA含量變化 采用Trizol法抽提細(xì)胞總RNA，SYBR Green法進(jìn)行real-time PCR。TNF-α上游引物 5’-TAGCCCATGTTGTAGCAAACC-3’,下游引物5’-ATGAGGTACAGGCCCTCTGAT-3’;NF-κB p65上游引物5’-GGAGCACAGATACCACCAAGA-3’,下游引物5’-CGCTTCTTCACACACTGGAT-3’；TLR4上游引物5’-TGTCCCTGAACCCTATGAACTT-3’，下游引物5’-CTTCTAAACCAGCCAGACCTTG-3’；GAPDH上游引物5’-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’,下游引物5’-GCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3’。每個樣品重復(fù)3次，與內(nèi)參照均一化消除誤差后取平均值，用2-ΔΔCt法計算基因表達(dá)水平。

3統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 11.0軟件分析，多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA檢驗，組間兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1Ⅷ因子相關(guān)抗原鑒定

免疫組化染色可見細(xì)胞呈梭形或多邊形，胞漿豐富，胞漿內(nèi)可見棕黃色染色顆粒，證實細(xì)胞為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，見圖1。

Figure 1. The expression of factor Ⅷ in HUVECs detected by immunohistochemistry (×200).

圖1免疫組化法檢測HUVECs內(nèi)人Ⅷ因子相關(guān)抗原

2Ang-4對LPS誘導(dǎo)的HUVECs活力的影響

與正常組比較，LPS組細(xì)胞活力明顯受抑制(P<0.01)；與LPS組比較 ，Ang-4(10 μg/L、20 μg/L和50 μg/L)組細(xì)胞活力無明顯變化，Ang-4(100 μg/L和200 μg/L)組活力明顯增強(qiáng)(P<0.01)，Ang-4(100 μg/L)組和Ang-4(200 μg/L)組比較細(xì)胞活力無明顯變化，見表1，說明一定濃度的Ang-4對LPS誘導(dǎo)的HUVECs損傷有一定的保護(hù)作用，可改善細(xì)胞活力。

表1各組細(xì)胞活力的比較

Table 1. Comparison of cell viability among groups (Mean±SD.n=6)

GroupAInhibitoryrateControl0.699±0.0100LPS0.418±0.007*40.20%*LPS+Ang-4(10μg/L)0.421±0.005*39.77%*LPS+Ang-4(20μg/L)0.422±0.006*39.63%*LPS+Ang-4(50μg/L)0.425±0.006*39.20%*LPS+Ang-4(100μg/L)0.473±0.007*△32.33%*△LPS+Ang-4(200μg/L)0.481±0.006*△31.19%*△

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsLPS group.

3Ang-4對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖2所示，正常組(A)細(xì)胞胞漿豐富，細(xì)胞間連接緊密，邊界清楚，呈單層鋪路石狀排列，細(xì)胞呈多角形、梭形或卵圓形；LPS組(B)細(xì)胞變圓縮，胞體變小，細(xì)胞間隙增寬，邊界模糊；Ang-4(100 μg/L)組(C)較模型組細(xì)胞生長狀態(tài)好，邊界較清楚。

4Ang-4對LPS誘導(dǎo)HUVCEs損傷釋放的vWF及TNF-α含量的影響

LPS組比正常組vWF含量明顯增高(P<0.01)，Ang-4組與LPS組比較，vWF含量明顯降低(P<0.01)；在細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果反之，見表2，表明Ang-4可減輕LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，減少vWF胞內(nèi)釋放。LPS組上清液TNF-α含量比正常組顯著升高(P<0.01)，Ang-4組與LPS組比較，TNF-α含量明顯降低(P<0.01)，見表2，表明Ang-4可一定程度上降低TNF-α的表達(dá)而減輕LPS所致細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

Figure 2. Cell morphology observed under an inverted microscope (×100).A: control group; B: LPS group; C: LPS+Ang-4 (100 μg/L) group.

圖2細(xì)胞倒置顯微鏡觀察Ang-4對細(xì)胞形態(tài)的影響

表2 各組細(xì)胞中vWF及TNF-α含量比較

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsLPS group.

5Real-timePCR測TLR4、NF-κBp65和TNF-αmRNA含量變化

與正常組相比，模型組TLR4、NF-κB p65和TNF-α mRNA表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組相比，Ang-4(100 μg/L)組三者含量顯著降低(P<0.01)，見表3，表明Ang-4預(yù)處理可能抑制了LPS誘導(dǎo)的TLR4-NF-κB p65-TNF-α信號通路激活。

討 論

肺血管內(nèi)皮細(xì)胞是ALI/ARDS重要的靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞， LPS是TLR信號途徑的配基，能特異性地與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的TLR4結(jié)合，激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)一系列炎癥蛋白的表達(dá)[2]。以內(nèi)皮細(xì)胞作為新的治療靶點，干預(yù)內(nèi)皮屏障破壞所致的血管損傷有可能為治療ALI/ARDS提供新思路。

表3 各組細(xì)胞real-time PCR結(jié)果

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsLPS group.

國內(nèi)外有關(guān)Ang-4生物學(xué)效應(yīng)的研究較少，尚無統(tǒng)一定論。Ang-4可抑制人類小細(xì)胞肺癌的血管生成及改善血管高滲透狀態(tài)，抑制細(xì)胞增殖；而Brunckhorst等[3]發(fā)現(xiàn)，Ang-4可以通過激活細(xì)胞外細(xì)胞信號調(diào)節(jié)激酶促進(jìn)多形性惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。Olsen等[4]證實，Ang-4可抑制由堿性成纖維細(xì)胞生長因子及血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移；而Lee研究發(fā)現(xiàn)，Ang-4重組蛋白可顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化而激動Tie-2，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、成熟。Yamakawa等[5]研究示，Ang-4表達(dá)上調(diào)可減輕新生的毛細(xì)血管滲漏、組織水腫及炎癥，也證明了Ang-4在血管發(fā)生后起到穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)、減輕炎癥的作用。

本實驗應(yīng)用10 mg/L LPS刺激HUVECs，不同濃度的Ang-4干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS處理可誘導(dǎo)一系列細(xì)胞損傷表現(xiàn)，而Ang-4(100 μg/L)組可拮抗LPS誘導(dǎo)的損傷效應(yīng)。有研究[6]表明，LPS通過與內(nèi)皮細(xì)胞表面的TLR4結(jié)合，激活NF-κB信號通路，促進(jìn)NF-κB核內(nèi)轉(zhuǎn)移，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥因子TNF-α等釋放，損害內(nèi)皮細(xì)胞并致其通透性增加、功能障礙。vWF可作為內(nèi)皮激活、受損、滲漏性損傷和功能障礙的標(biāo)志物[7]。本實驗血清v-WF濃度升高即可表征內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。Ang-4對LPS引起的HUVECs損傷有保護(hù)作用，可能與Ang-4抑制LPS誘導(dǎo)TLR4-NF-κBp65-TNF-α信號通路的活化有關(guān)，而Ang-4具體在哪個環(huán)節(jié)阻斷了信號通路尚未得知，后續(xù)實驗會深入研究。Wang等[8]研究表明，LPS刺激HUVECs損傷與TLR4及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路元件髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、Toll樣受體相關(guān)的干擾素活因化子(Toll/IL-1 receptor domain-containing adaptor inducing IFN-β,TRIF)有關(guān)，而MyD88與TRIF是NF-κB上游重要的信號分子;有研究顯示LPS刺激可引起TLR4、MyD88、TRIF mRNA高表達(dá)，故Ang-4改善LPS的損傷效應(yīng),可能與抑制LPS-TLR4-MyD88/TRIF-NF-κB p65-TNF-α信號通路有關(guān)。

綜上所述，Ang-4可拮抗LPS誘導(dǎo)的HUVECs損傷，有一定的血管保護(hù)及抗炎作用，其機(jī)制可能與抑制LPS誘導(dǎo)TLR4-NF-κB p65-TNF-α信號通路活化有關(guān)。本研究為全面揭示ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制提供了新的實驗依據(jù)。

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Effectsofangiopoietin4onlipopolysaccharide-inducedinjuryofhumanumbilicalveinendothelialcells

LI Yan1, MA Ming-ming1, ZHANG Xiao-qiang2, PAN Wen-fei3, LIU Xiang-yong3, WANG Xiao-zhi1

(1DepartmentofIntensiveCareUnit,AffiliatedHospitalofBinzhouMedicalUniversity,Binzhou256603,China;2DepartmentofIntensiveCareUnit,DezhouPeople'sHospital,Dezhou253014,China;3DepartmentofCellBiology,BinzhouMedicalUniversity,Yantai264003,China.E-mail:hxicuwxz@163.com)

AIM: To observe the effects of angiopoietin 4 (Ang-4) on lipopolysaccharide (LPS)-induced injury of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).METHODSThe EnVision immunohistochemical method was used to identify the HUVECs. After pre-treated with different doses of Ang-4 for 0.5 h, HUVECs was exposed to LPS at concentration of 10 mg/L for 24 h. The cell viability was evaluated by MTT assay. The content of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) in the supernatant and the concentrations of intracellular and supernatant von Willebrand factor (vWF) were detected by ELISA. The mRNA levels of Toll-like receptor 4 (TLR4), NF-κB p65 and TNF-α were determined by real-time PCR.RESULTSFactor Ⅷ in the cytoplasm was positive in the HUVECs.Compared with normal group, LPS reduced the cell viability (P<0.01), and significantly increased the secretion of TNF-α and vWF (P<0.01). The mRNA expression of TLR4, NF-κB p65 and TNF-α also increased (P<0.01). Ang-4 at concentration of 100 μg/L enhanced the cell viability (P<0.01), reduced the content of vWF and TNF-α, and inhibited the LPS-induced increases in the mRNA levels of TLR4, NF-κB p65 and TNF-α (P<0.01).CONCLUSIONAng-4 antagonizes LPS-induced damage in HUVECs by inhibiting TLR4-NF-κB p65-TNF-α signaling pathways.

Angiopoietin 4; Lipopolysaccharides; Human umbilical vein endothelial cells; von Willebrand factor

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.031

1000- 4718(2013)11- 2088- 04

2013- 04- 21

2013-09 - 16

山東省自然科學(xué)基金資助項目(No.Y2008C163)；泰山學(xué)者建設(shè)工程資助項目； 濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)科帶頭人與學(xué)術(shù)骨干支持計劃資助項目(No.510906)

△通訊作者 Tel: 0543-3256795; E-mail: hxicuwxz@163.com