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    正常整倍體及21三體胎盤組織的甲基化標(biāo)志物研究*

    2013-10-24 06:35:16尹玉竹郝秀蘭侯紅瑛
    中國病理生理雜志 2013年11期
    關(guān)鍵詞:整倍體三體甲基化

    佘 芹, 尹玉竹, 郝秀蘭, 章 鈞, 侯紅瑛

    (中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科, 廣東 廣州 510630)

    正常整倍體及21三體胎盤組織的甲基化標(biāo)志物研究*

    佘 芹#, 尹玉竹△, 郝秀蘭, 章 鈞, 侯紅瑛

    (中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科, 廣東 廣州 510630)

    目的聯(lián)合應(yīng)用甲基化特異性多重連接依賴的探針擴(kuò)增技術(shù)(MS-MLPA)及亞硫酸氫鹽測(cè)序2種方法進(jìn)行胎盤組織甲基化研究,以尋找可用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷21三體綜合征的甲基化標(biāo)志物。方法用MS-MLPA和亞硫酸氫鹽測(cè)序2種方法對(duì)15例正常整倍體孕婦和11例21三體孕婦的胎盤組織,以及13例非孕婦女外周血進(jìn)行甲基化檢測(cè),并計(jì)算候選的3個(gè)基因(4個(gè)位點(diǎn))CGI149、CGI045、HLCS-1和HLCS-2的甲基化率。結(jié)果(1)MS-MLPA與亞硫酸氫鹽測(cè)序所測(cè)得的甲基化率一致。(2)所選的4個(gè)位點(diǎn),在13例非孕婦女外周血樣本中CGI149、CGI045和HLCS-2三個(gè)位點(diǎn)均未甲基化;在15例整倍體胎盤中,CGI149有13例(2例未甲基化)、CGI045有11例(4例未甲基化)、HLCS(包括HLCS-1和HLCS-2)有15例甲基化;在11例21三體胎盤中,CGI149有10例(1例未甲基化)、CGI045及HLCS(包括HLCS-1和HLCS-2)均有11例甲基化。只有HLCS-2符合在所有外周血細(xì)胞中均未甲基化,在所有胎盤組織中均甲基化。比較4個(gè)位點(diǎn)的甲基化率在正常整倍體胎盤與21三體胎盤的不同,只有CGI149有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其它3個(gè)位點(diǎn)(CGI045、HLCS-1和HLCS-2)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論(1)MS-MLPA可代替亞硫酸氫鹽測(cè)序用于胎盤的甲基化研究。(2)本研究所選擇的CGI045、CGI149、HLCS-1和HLCS-2不適合用作21三體的甲基化標(biāo)志物,需進(jìn)一步尋找新的位點(diǎn)。

    DNA甲基化; 21三體綜合征; 無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷; 亞硫酸氫鹽測(cè)序

    21三體綜合征是人類最早發(fā)現(xiàn)且最常見的一種常染色體病,在活產(chǎn)嬰兒中的發(fā)病率約為1/600~1/800[1-2]。目前對(duì)21三體綜合征的產(chǎn)前診斷技術(shù)主要是絨毛活檢、羊膜腔穿刺以及臍血穿刺等有創(chuàng)性方法,可能對(duì)胎兒或孕婦造成一定的危害,因此從孕婦外周血中提取胎兒游離DNA進(jìn)行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷成為研究熱點(diǎn)和方向。但母血中胎兒游離DNA僅占3%~6%[3],因此,要將胎兒游離DNA從大量母體DNA背景中分離出來,必須采用特異、高效的胎兒DNA標(biāo)志物,而母胎間存在甲基化差異的位點(diǎn)為解決上述問題提供了新的契機(jī)。

    亞硫酸氫鹽測(cè)序是最經(jīng)典的甲基化研究方法,但其步驟繁瑣、昂貴、對(duì)DNA損耗大,限制了其在臨床中的廣泛運(yùn)用,尤其不適合進(jìn)行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。2005年,Nygren等[4]改進(jìn)多重連接依賴的探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)為甲基化特異性MLPA(methylation-specific MLPA,MS-MLPA)用于檢測(cè)特異位點(diǎn)的甲基化,為甲基化研究提供了一種新的方法。故本課題聯(lián)合應(yīng)用MS-MLPA及亞硫酸氫鹽測(cè)序2種方法進(jìn)行胎盤組織甲基化研究,以尋找可用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷 21三體綜合征的甲基化標(biāo)記物。

    材 料 和 方 法

    1材料

    1.1胎盤組織的獲取 取2011年1月至2012年3月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科因計(jì)劃外懷孕要求引產(chǎn)并經(jīng)羊水穿刺細(xì)胞培養(yǎng)證實(shí)為正常整倍體的孕婦15例,以及因唐氏高風(fēng)險(xiǎn)(9例)、高齡妊娠(1例)、胎兒水腫綜合征而行羊水穿刺確診為21三體綜合征的孕婦11例,分娩后分別取其胎盤組織。取胎盤組織前均經(jīng)孕婦本人知情同意。

    1.2非孕婦女外周血的獲取 選取在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科工作的正常未婚未孕婦女13例,留取其外周血2 mL。

    2方法

    2.1基因組DNA的提取

    2.1.1胎盤組織DNA 娩出胎盤后即在胎兒面取直徑約1 cm的胎盤小葉,剪碎后用生理鹽水反復(fù)沖洗,取25 mg用于提取DNA。采用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen),按說明書操作提取DNA,測(cè)定所提DNA在260 nm和280 nm處的吸光度(A),計(jì)算DNA濃度及純度,要求A260/A280在1.8~2.0。使用pH為8.0的TE緩沖液將DNA稀釋至終濃度為100 mg·L-1。

    2.1.2外周血DNA 用EDTA抗凝管取非孕婦女肘靜脈血2 mL,混勻后取200 μL用于提取DNA,步驟同上。

    2.2亞硫酸氫鹽測(cè)序

    2.2.1亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化 取200~500 ng胎盤組織DNA,選用Zymo Research公司的EZ DNA Methylation-Direct? Kit,按照說明書操作進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化,取1 μL DNA進(jìn)行下一步的PCR反應(yīng)。

    2.2.2轉(zhuǎn)化后的DNA PCR擴(kuò)增、克隆測(cè)序 按照下面的流程, 參照試劑說明書操作:以轉(zhuǎn)化后的DNA 為模板分別擴(kuò)增3個(gè)基因(4個(gè)位點(diǎn):CGI149、CGI045、HLCS-1和HLCS-2)的目的片段(引物見表1),回收PCR 產(chǎn)物,用TaKaRa公司的pMD 18-T載體與PCR產(chǎn)物連接反應(yīng),用TaKaRa公司的感受態(tài)大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化,取400 μL菌液涂板后37 ℃溫箱孵育,每個(gè)基因挑選10個(gè)以上克隆進(jìn)行酶切鑒定,陽性克隆取200 μL菌液送上海英駿生物公司測(cè)序。將每個(gè)克隆的測(cè)序結(jié)果去除載體和引物后, 以純文本格式保存,并與相應(yīng)的基因組序列文件放在同一目錄下。分析每個(gè) CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài),并計(jì)算每個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化率。

    表1 亞硫酸氫鹽測(cè)序引物

    2.3MS-MLPA 選用MLPA Mental Retardation-1試劑盒(SALSA P300; MRC-Holland),包括4個(gè)質(zhì)量控制探針、17個(gè)不含“GCGC”酶切位點(diǎn)的內(nèi)參照探針及1個(gè)含“GCGC”酶切位點(diǎn)的消化內(nèi)參照,探針序列詳見說明書。MS-MLPA操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,本課題設(shè)計(jì)的目的探針見表2。取1 μL PCR產(chǎn)物使用ABI 3100測(cè)序儀進(jìn)行位點(diǎn)分析,所得數(shù)據(jù)采用GeneMarker 1.71軟件處理, 得出每個(gè)探針的峰值高度,然后利用以下公式計(jì)算每個(gè)基因位點(diǎn)的甲基化率(methylation ratio,MR)。MR=(Hx/HCtrl)digested/(Hx/HCtrl)undigested[MR: 0~1.0(0~100%);Hx:目的探針的峰值;HCtrl:所有內(nèi)參照探針(消化內(nèi)參照除外)的峰值之和;digested:HhaI消化后的樣本;undigested:未經(jīng)HhaI消化的樣本]。

    表2 MS-MLPA寡核苷酸探針序列

    3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理,用Shapiro-WilkW檢驗(yàn)兩組(正常整倍體胎盤與21三體綜合征胎盤)定量資料的正態(tài)性,當(dāng)兩組資料呈正態(tài)分布且方差齊時(shí),用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),否則用秩和檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1非孕婦女外周血細(xì)胞的甲基化檢測(cè)及MR截?cái)嘀档慕?/p>

    首先用亞硫酸氫鹽測(cè)序方法對(duì)13例非孕婦女外周血樣本進(jìn)行甲基化檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在所選取的3個(gè)基因(4個(gè)位點(diǎn))中,有3個(gè)位點(diǎn)(CGI149、CGI045和HLCS-2)未甲基化,而HLCS-1在1例(1/13)樣本中未甲基化,12例(12/13)樣本中甲基化,另外,有研究證實(shí)β-actin在胎盤及非孕婦女外周血中是完全未甲基化的[5],故本課題選用β-actin作為消化內(nèi)參照并用亞硫酸氫鹽測(cè)序方法進(jìn)行克隆驗(yàn)證,證實(shí)所選取的β-actin目的片段完全未甲基化。之后將β-actin探針加入到SALSA MLPA P300A1 Reference-2中,對(duì)13例非孕婦女外周血樣本進(jìn)行MS-MLPA檢測(cè),發(fā)現(xiàn)當(dāng)SALSA MLPA P300A1 Reference-2的消化內(nèi)參照消化完全時(shí),β-actin的MR值波動(dòng)在0~0.1之間,見圖1。因此,本研究認(rèn)為,當(dāng)MR>0.1,樣本甲基化,當(dāng)≤0.1,樣本未甲基化?;诮?cái)嘀?.1,我們用MS-MLPA方法對(duì)13例非孕婦女外周血樣本進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)所選取的3個(gè)基因(4個(gè)位點(diǎn))中,CGI149、CGI045和HLCS-2均未甲基化,見圖2,與亞硫酸氫鹽測(cè)序的結(jié)果一致。

    2正常整倍體胎盤的甲基化檢測(cè)

    用亞硫酸氫鹽測(cè)序和MS-MLPA兩種方法對(duì)15例正常整倍體胎盤進(jìn)行甲基化檢測(cè),在所選取的3個(gè)基因(4個(gè)位點(diǎn))中,CGI149在13例樣本中甲基化而在2例樣本中未甲基化,CGI045在11例樣本中甲基化而在4例樣本中未甲基化,HLCS基因(包括HLCS-1及HLCS-2)在15例樣本中均甲基化,見圖2。MS-MLPA與亞硫酸氫鹽測(cè)序檢測(cè)結(jié)果一致。

    321三體胎盤的甲基化檢測(cè)

    用2種方法對(duì)11例21三體胎盤進(jìn)行甲基化檢測(cè),在所選取的3個(gè)基因(4個(gè)位點(diǎn))中,CGI149在10例樣本中甲基化而在1例樣本中未甲基化,CGI045及HLCS基因(包括HLCS-1及HLCS-2)在11例樣本中均甲基化,見圖2。MS-MLPA與亞硫酸氫鹽測(cè)序檢測(cè)結(jié)果一致。

    4比較4個(gè)位點(diǎn)的甲基化率在正常整倍體胎盤與21三體胎盤中的不同

    將3個(gè)基因(4個(gè)位點(diǎn))在正常整倍體胎盤及21三體胎盤的甲基化率進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)只有CGI149差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其它3個(gè)位點(diǎn)(CGI045、HLCS-1和HLCS-2)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表3。

    Figure 1. Non-pregnant woman blood cells analysed by MS-MLPA (A) and the methylation ratios of β-actin (B). When the digestion control (184 bp) was digested completely, the methylation ratios of β-actin in non-pregnant woman blood cells were 0~0.1.

    圖1非孕婦女外周血MS-MLPA檢測(cè)示意圖及β-actin的甲基化率

    Figure 2. The methylation ratios of the 4 fragments in blood cells from non-pregnant women (n=13), and in placental tissues from euploid (n=15) and trisomy 21 (n=11) pregnant women. Mean±SD.

    圖2非孕婦女外周血(13例)、正常整倍體孕婦胎盤組織(15例)和21三體孕婦胎盤組織(11例)4個(gè)位點(diǎn)的甲基化率

    討 論

    隨著DNA甲基化研究的深入,母胎間存在甲基化差異的基因,為21三體綜合征的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷帶來了新的機(jī)遇。亞硫酸氫鹽測(cè)序是目前進(jìn)行DNA甲基化研究的金標(biāo)準(zhǔn),但其對(duì)DNA損耗大,而孕婦外周血中胎兒DNA含量?jī)H3%~6%,顯然,亞硫酸氫鹽測(cè)序不適合用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。MS-MLPA是一種快速、高通量的定量技術(shù),可以對(duì)基因的拷貝數(shù)和甲基化狀態(tài)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),它需要的樣本DNA量很少(20~200 ng),也不需要對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化,僅需要甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶對(duì)特異性的探針和DNA結(jié)合序列進(jìn)行消化,另外,與亞硫酸氫鹽測(cè)序相比,MS-MLPA花費(fèi)較低,且每次反應(yīng)可以多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行,而亞硫酸氫鹽測(cè)序每次只能對(duì)1個(gè)樣本的1個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行克隆測(cè)序。因此本課題嘗試選用MS-MLPA對(duì)胎盤組織及外周血標(biāo)本進(jìn)行甲基化研究,以探討其可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MS-MLPA與亞硫酸氫鹽測(cè)序結(jié)果一致,因此我們認(rèn)為MS-MLPA可以取代亞硫酸氫鹽測(cè)序?qū)μケP組織及外周血標(biāo)本進(jìn)行甲基化研究。

    表3HLCS-1、HLCS-2、CGI149及CGI045的甲基化率在正常整倍體胎盤及21三體胎盤組織中的比較

    Table 3. Comparison of DNA methylation ratios of HLCS-1,HLCS-2,CGI149 and CGI045 between euploid and trisomy 21 placental tissues

    GroupnHLCS-1*HLCS-2*CGI149*CGI045#(Mean±SD)MedianP25~P75MedianP25~P75MedianP25~P75Euploidplacentaltissue150.71800.6045~0.74200.57670.4735~0.70490.45780.3568~0.51690.2602±0.1834Trisomy21placentaltissue110.75650.6043~0.84300.67720.5911~0.7177 0.5918△△0.5618~0.66590.3794±0.1679

    *Kruskal-Wallis test was used;#ttest for two independent samples was used.△△P<0.01vseuploid placental tissue.

    孕婦血漿中胎兒DNA[5]主要來源于胎盤,而21號(hào)染色體上理想的可用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷21三體綜合征的胎盤特異性DNA甲基化標(biāo)記物應(yīng)滿足以下3個(gè)條件:(1)所選的CpG位點(diǎn)在母體血細(xì)胞中完全未甲基化(MR≤0.1);(2)在所有胎盤組織中甲基化(MR≥0.1);(3)所選的CpG位點(diǎn)的甲基化率在正常整倍體和21三體綜合征胎盤組織之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2008年,Chim等[6]系統(tǒng)地分析了21號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的CpG島。在所研究的2 440個(gè) CpG位點(diǎn)中,發(fā)現(xiàn)有255個(gè)CpG位點(diǎn)可以用于進(jìn)一步研究。在這 255個(gè)CpG位點(diǎn)中,有127個(gè)CpG位點(diǎn)在胎盤組織中甲基化而在母體血細(xì)胞中完全未甲基化。在這127個(gè)CpG位點(diǎn)中,有29個(gè)CpG位點(diǎn)含甲基化敏感的HhaⅠ識(shí)別位點(diǎn)。我們?cè)谶@29個(gè)位點(diǎn)中隨機(jī)選擇了2個(gè)位點(diǎn)(CGI045和CGI149)進(jìn)行研究。2010年Tong等[7]再次使用COBRA方法研究21號(hào)染色體上的非CpG島,并成功地發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的甲基化區(qū)——HLCS基因啟動(dòng)子區(qū),該研究將HLCS基因啟動(dòng)子區(qū)分為A、B1、B2三個(gè)區(qū)分別進(jìn)行研究,其中,B2區(qū)中的CpG位點(diǎn)在胎盤組織中高甲基化而在外周血中低甲基化或未甲基化,在B2區(qū)中,共有37個(gè)CpG位點(diǎn),在這37個(gè)CpG位點(diǎn)中有6個(gè)CpG位點(diǎn)含甲基化敏感的HhaI識(shí)別位點(diǎn),我們?cè)谶@6個(gè)位點(diǎn)中隨機(jī)選擇了2個(gè)位點(diǎn)(HLCS-1和HLCS-2)進(jìn)行研究。

    在研究選取的4個(gè)位點(diǎn)(CGI045、CGI149、HLCS-1和HLCS-2)中,我們發(fā)現(xiàn)CGI045、CGI149和HLCS-2在所有非孕婦女外周血細(xì)胞中均未甲基化,HLCS-1和HLCS-2在所有胎盤組織中均甲基化。因此,只有HLCS-2同時(shí)滿足條件(1)(在母體血細(xì)胞中完全未甲基化)和條件(2)(在所有胎盤組織中甲基化)。但是該基因在正常整倍體和21三體綜合征胎盤組織中的甲基化率比較上差異卻沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此不滿足條件(3)。另外,雖然CGI149在所有非孕婦女外周血細(xì)胞中均未甲基化,并且在正常整倍體和21三體綜合征胎盤組織中的甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,同時(shí)滿足條件(1)和(3)。但是,該位點(diǎn)有2例(2/15)整倍體胎盤樣品和1例(1/11)21三體胎盤樣品未甲基化,不滿足條件(2)。故我們選擇的3個(gè)基因(4個(gè)位點(diǎn))均不能被用無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷21三體綜合征,結(jié)果與文獻(xiàn)[6-7]的研究不同,其原因可能與以下因素有關(guān)。(1)個(gè)體間的差異。因?yàn)镈NA甲基化模式,可以受個(gè)體內(nèi)部和外部因素的影響。雙胞胎的研究已經(jīng)驗(yàn)證了這一現(xiàn)象[8]。該研究選取同卵雙胎為研究對(duì)象,探討在環(huán)境因素改變后,雙胎之間部分基因的甲基化出現(xiàn)差別,進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)一些疾病的易感性不同。此外,2013年,Schroeder等[9]通過研究人類胎盤的甲基化組,發(fā)現(xiàn)37%的胎盤基因組具有部分甲基化區(qū)域。因此,胎盤在發(fā)育過程中,在個(gè)體內(nèi)、外環(huán)境因素的影響下,可能會(huì)出現(xiàn)通過給某個(gè)或某些DNA添加甲基或脫甲基來調(diào)控基因的表達(dá),進(jìn)而影響胎盤的發(fā)育及胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育。(2)母體因素:2012年,Wilhelm-Benartzi等[10]研究發(fā)現(xiàn)孕婦吸煙及酗酒會(huì)影響胎盤基因的甲基化狀態(tài),進(jìn)而影響胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育。Bouchard等[11]研究發(fā)現(xiàn)胎盤的甲基化水平與孕婦的血糖濃度相關(guān)。Gordon等[12]選取雙胎為研究對(duì)象再次證實(shí)胎盤的甲基化狀態(tài)受外界因素影響(宮內(nèi)環(huán)境或其它因素)。(3)妊娠并發(fā)癥:2011年,Kulkarni等[13]研究發(fā)現(xiàn)胎盤的甲基化狀態(tài)與子癇前期相關(guān)。2011年,Banister等[14]研究發(fā)現(xiàn)胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限與胎盤的甲基化狀態(tài)相關(guān)。由于本研究納入的都是中孕期婦女,孕周小于28周,故尚不能排除是否會(huì)發(fā)生先兆子癇、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限等妊娠并發(fā)癥,是否會(huì)導(dǎo)致胎盤基因甲基化狀態(tài)的不同尚無法證實(shí)。

    綜上所述,MS-MLPA檢測(cè)甲基化率結(jié)果可靠,可代替亞硫酸氫鹽測(cè)序用于胎盤的甲基化研究。本課題所選擇的CGI045、CGI149和 HLCS-1、HLCS2不適合用于21三體綜合征甲基化標(biāo)記物,需進(jìn)一步尋找新的位點(diǎn)。

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    Methylationmarkersinplacentatissuesofeuploidandtrisomy21

    SHE Qin, YIN Yu-zhu, HAO Xiu-lan, ZHANG Jun, HOU Hong-ying

    (DepartmentofObstetricsandGynecology,theThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:yzzst2011@163.com)

    AIM: To explore the DNA methylation markers for non-invasive prenatal diagnosis of trisomy 21.METHODSThe DNA methylation ratios of 3 genes (4 fragments) on chromosome 21 (CGI149, CGI045, HLCS-1 and HLCS-2) in blood cells from 13 non-pregnant women, and in placental tissues from 15 euploid and 11 trisomy 21 pregnant women were measured using the methods of methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification (MS-MLPA) and bisulfite sequencing in combination.RESULTSThe results obtained from MS-MLPA were consistent with the results from bisulfite sequencing. The fragments of CGI149, CGI045 and HLCS-2 were unmethylated in the non-pregnant woman blood cells. HLCS-1 and HLCS-2 were methylated in all euploid and all trisomy 21 placentae. CGI149 was methylated in 13 (13/15) of the euploid and 10 (10/11) of the trisomy 21 placental tissues. CGI045 was methylated in 11 (11/15) of the euploid and all the Trisomy 21 placental tissues. Only HLCS-2 was found to be methylated in all placental tissues but unmethylated in all non-pregnant woman blood cells. Only the DNA methylation ratio in CGI149 was significantly different between euploid and trisomy 21 placental tissue (P<0.05). No difference among HLCS-1, HLCS-2 and CGI045 was observed.CONCLUSIONMS-MLPA is an effective alternative to bisulfite sequencing for the assessment of methylation ratios in placental tissue. CGI149, CGI045, HLCS-1 and HLCS-2 are not appropriate DNA methylation markers for non-invasive prenatal diagnosis of trisomy 21.

    DNA methylation; Trisomy 21; Non-invasive prenatal diagnosis; Bisulfite sequencing

    R363

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.029

    1000- 4718(2013)11- 2076- 06

    2013- 06- 20

    2013- 09- 10

    廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2010B060900031)

    △通訊作者 Tel: 020-85252172; E-mail: yzzst2011@163.com

    # 現(xiàn)在工作單位: 清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院

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