甲基硒酸對人三陰性乳腺癌細(xì)胞化療增敏作用的機(jī)制探討*

邱萬壽， 唐 勇， 劉 威， 吳玨堃， 李 璽

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院乳腺疾病診治中心，廣東 廣州 510630； 2長沙市中心醫(yī)院普外科，湖南 長沙 410004)

甲基硒酸對人三陰性乳腺癌細(xì)胞化療增敏作用的機(jī)制探討*

邱萬壽1△， 唐 勇2， 劉 威1， 吳玨堃1， 李 璽1

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院乳腺疾病診治中心，廣東 廣州 510630；2長沙市中心醫(yī)院普外科，湖南 長沙 410004)

目的觀察甲基硒酸(methylseleninic acid，MSA)對人三陰性乳腺癌細(xì)胞的化療增敏作用及其機(jī)制。方法采用MSA聯(lián)合紫杉醇、阿霉素與三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株共培養(yǎng)，分別應(yīng)用CCK-8實(shí)驗檢測化療藥物單藥和聯(lián)合MSA用藥時細(xì)胞增殖抑制率，并通過計算合用指數(shù)，探討MSA對化療藥物療效的影響；用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的分布情況；應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡變化。結(jié)果不同濃度化療藥物聯(lián)合MSA后細(xì)胞增殖率較單用化療藥物組均下降，呈明顯的量-效關(guān)系，提示MSA與化療藥物具協(xié)同作用；紫杉醇聯(lián)合MSA時G2/M期細(xì)胞較單藥明顯增多(P<0.05)，阿霉素聯(lián)合MSA時S期細(xì)胞較單藥明顯增多(P<0.05)，提示MSA增強(qiáng)了抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞周期阻滯效應(yīng)；與單用同一濃度的同一化療藥物相比，10 nmol/L紫杉醇聯(lián)合3.5 μmol/L MSA后細(xì)胞凋亡率由41.1%上升至59.3%(P<0.05)，0.5 μmol/L阿霉素聯(lián)合3.5 μmol/L MSA后細(xì)胞凋亡率由30.2%上升至51.9%(P<0.01)，提示MSA增強(qiáng)了抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。結(jié)論MSA能增強(qiáng)化療藥物阿霉素和紫杉醇對三陰乳腺癌細(xì)胞的抗腫瘤效果，其機(jī)制之一可能是增強(qiáng)了抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡和周期阻滯效應(yīng)。

甲基硒酸； 三陰性乳腺癌； 化療增敏； 細(xì)胞周期阻滯； 細(xì)胞凋亡

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是一類侵襲性強(qiáng)，容易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差的高危乳腺癌。由于其缺乏雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)表達(dá)，因而不能從內(nèi)分泌治療和分子靶向治療中獲益。而化療成為TNBC患者術(shù)后最重要和有效的治療方式，如何提高化療效果是我們醫(yī)生努力的方向之一。有研究[1-2]證實(shí)含硒化合物對人TNBC細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。同時研究顯示甲基硒酸(methylseleninic acid，MSA)是具有抗腫瘤作用的含硒小分子化合物，在前列腺癌中能增強(qiáng)某種特定化療藥物的化療療效，具有明顯的化療增敏作用[3]。本研究初步探討MSA對三陰乳腺癌細(xì)胞的化療增敏作用，并分析其可能的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

三陰性乳腺癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心的MDA-MB-231細(xì)胞株復(fù)蘇、傳代。MSA由暨南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院化學(xué)系陳填烽教授惠贈。

2方法

2.1分組 分為無藥物處理組、MSA處理組、紫杉醇處理組、阿霉素處理組、紫杉醇聯(lián)合MSA組和阿霉素聯(lián)合MSA組。MSA濃度分別為2.5、3.5和4.0 μmol/L，紫杉醇濃度分別為10、20和40 nmol/L，阿霉素濃度分別為0.5、1.0和2.0 μmol/L。

2.2細(xì)胞增殖與毒性的檢測 將100 μL MDA-MB-231細(xì)胞按5×107/L接種于96孔板后在恒溫37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞貼壁后分別向每孔中添加實(shí)驗設(shè)計濃度的MSA、紫杉醇及阿霉素，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，無藥物處理組和空白對照組加PBS，將加藥的細(xì)胞置入培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24 h后向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，再將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱孵育1 h。用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光度(A)，各組的A值取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差用于計算增殖及抑制率。細(xì)胞增殖率(%)=(空白組A值-藥物處理組A值/空白組A值-無藥物處理組A值)×100%，細(xì)胞抑制率(%)=1-細(xì)胞增殖率。

2.3細(xì)胞周期的檢測 分別向培養(yǎng)皿中添加實(shí)驗設(shè)計濃度的MSA、紫杉醇及阿霉素，無藥物處理組加PBS，將加藥的細(xì)胞置入培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24 h后采用不含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的胰酶消化收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，去培養(yǎng)基后用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞。洗滌后將細(xì)胞再次1 000 r/min離心5 min，去PBS后用預(yù)冷的70%無水乙醇重懸細(xì)胞，4 ℃固定2 h。再次離心去除固定液，預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×109/L。加入碘化丙啶(propidium iodide, PI)工作液，4 ℃避光反應(yīng)30 min。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。

2.4細(xì)胞凋亡的檢測 將各組細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后采用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，去培養(yǎng)基后用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，重復(fù)2次。加入500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI。將細(xì)胞輕吹打混勻，室溫下避光孵育15 min。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1MSA增強(qiáng)了化療藥物對細(xì)胞增殖抑制作用

不同濃度化療藥物聯(lián)合MSA后細(xì)胞增殖率較單用化療藥物組均下降，見表1、2。當(dāng)MSA濃度為3.5 μmol/L時作用更加顯著。10 nmol/L紫杉醇單藥應(yīng)用時增殖率為47.8%，聯(lián)合3.5 μmol/L MSA后增殖率下降到35.2%，20 nmol/L紫杉醇單藥應(yīng)用時增殖率為42.3%，聯(lián)合3.5 μmol/L MSA后增殖率下降到30.4%，40 nmol/L紫杉醇單藥應(yīng)用時增殖率為38.7%，聯(lián)合3.5 μmol/L MSA后增殖率下降到28.7%，藥物濃度增加，增殖抑制作用也越強(qiáng)。0.5 μmol/L阿霉素單藥應(yīng)用時增殖率為54.6%，聯(lián)合3.5 μmol/L MSA后增殖率下降到46.3%，1 μmol/L阿霉素單藥應(yīng)用時增殖率為49.3%，聯(lián)合3.5 μmol/L MSA后增殖率下降到40.6%，2 μmol/L阿霉素單藥應(yīng)用時增殖率為43.7%，聯(lián)合3.5 μmol/L MSA后增殖率下降到36.2%，同時我們還比較了不同濃度的化療藥物在加用MSA和單用時的細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果顯示聯(lián)合MSA后化療藥物的作用明顯增強(qiáng)(P<0.05)。

表1紫杉醇單藥及聯(lián)合MSA對TNBC細(xì)胞活力的影響

Table 1. Effects of paclitaxel or/and MSA on TNBC cell prolife-ration activity(%.Mean±SD.n=4)

Paclitaxel(nmol/L)MSA(μmol/L)02.53.54010090.3±11.277.6±8.762.4±8.11047.8±5.744.6±2.935.2±2.229.5±1.72042.3±2.836.1±2.330.4±1.726.1±3.84038.7±2.137.6±3.428.7±0.824.4±1.6

表2阿霉素單藥及聯(lián)合MSA對TNBC細(xì)胞活力的影響

Table 2. Effects of doxorubicin or/and MSA on TNBC cell proli-feration activity(%.Mean±SD.n=4)

Doxorubicin(μmol/L)MSA(μmol/L)02.53.54010090.3±11.277.6±8.762.4±8.10.554.6±6.350.1±5.946.3±3.241.2±3.71.049.3±5.145.4±3.340.6±4.137.3±3.92.043.7±4.139.5±4.436.2±2.932.4±4.2

為了判斷MSA與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用是否存在協(xié)同作用，我們利用Origin 8.6軟件對各藥物不同濃度抑制率作線性擬合，根據(jù)某種藥物產(chǎn)生x的效應(yīng)可以求得藥物濃度Dx1及Dx2，再根據(jù)中效原理計算兩藥聯(lián)用的合用指數(shù)(combination index，CI)。CI=D1/Dx1+D2/Dx2+D1·D2/Dx1·Dx2，D1、D2為合用時產(chǎn)生x效應(yīng)時兩藥各自所需的濃度(即實(shí)驗設(shè)計的藥物濃度)，Dx1、Dx2為兩藥單用時產(chǎn)生x效應(yīng)時各自的濃度。CI值以1為界值，CI大于1表示兩藥存在拮抗，等于1表示相加，小于1表示有協(xié)同作用。結(jié)果顯示MSA與阿霉素和紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用均存在協(xié)同作用,見表3、4。

表3 紫杉醇聯(lián)合MSA的合用指數(shù)

表4阿霉素聯(lián)合MSA的合用指數(shù)

Table 4. Combination index of doxorubicin in combination with MSA

Doxorubicin(μmol/L)MSA(μmol/L)2.53.54.00.50.9760.7830.8171.00.8240.7970.8092.00.7680.7440.797

2MSA增強(qiáng)了抗腫瘤藥物誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯

如圖1所示，單用3.5 μmol/L MSA時，細(xì)胞周期并沒有明顯變化，S期細(xì)胞稍有增加；10 nmol/L紫杉醇組與對照組比較，G0/G1期及S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞由17%增至42%(P<0.01)，10 nmol/L紫杉醇聯(lián)合3.5 μmol/L MSA組與10 nmol/L紫杉醇組比較，G2/M期細(xì)胞由42%增至57%(P<0.05)；0.5 μmol/L阿霉素組與對照組比較，S期細(xì)胞由26%增至37%(P<0.05)，0.5 μmol/L阿霉素聯(lián)合3.5 μmol/L MSA組與0.5 μmol/L阿霉素組比較，S期細(xì)胞由37%增加到47%(P<0.05)。

Figure 1. Effects of paclitaxel, doxorubicin and paclitaxel (T) or doxorubicin (A) in combination with MSA (M) on the cell cycle distribution of TNBC cells.

圖1紫杉醇、阿霉素及紫杉醇與阿霉素聯(lián)合MSA對細(xì)胞周期分布的影響

3甲基硒酸增強(qiáng)了抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡

MSA、紫杉醇及阿霉素對TNBC細(xì)胞均有誘導(dǎo)凋亡作用，MSA聯(lián)合化療藥物組的凋亡率較單藥組明顯增加。10 nmol/L紫杉醇聯(lián)合3.5 μmol/L MSA后細(xì)胞凋亡率由41.1%上升至59.3%(P<0.05)，0.5 μmol/L阿霉素聯(lián)合3.5 μmol/L MSA后細(xì)胞凋亡率由30.2%上升至51.9%(P<0.01)。

討 論

TNBC是一類缺乏ER/PR/HER2表達(dá)的高危類型乳腺癌，具有獨(dú)特的臨床病理學(xué)特點(diǎn)，腫瘤侵襲性強(qiáng)，生長迅速，瘤體較大，病理分型差，組織學(xué)分級高，易復(fù)發(fā)，軟組織和內(nèi)臟轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高，骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率相對較低，預(yù)后較差[4-5]。TNBC患者約占乳腺癌人群的12%～24%[6]。與非三陰性乳腺癌患者相比，由于缺乏激素受體及HER2表達(dá)，TNBC缺少內(nèi)分泌治療及分子靶向治療，術(shù)后輔助化療是主要的治療手段[7]。雖然大部分TNBC對化療較為敏感，但化療藥物的毒副作用限制其長期應(yīng)用。有研究表明在復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，希羅達(dá)等低毒高效藥物的維持化療能夠使TNBC患者獲益[8]。因此，小劑量維持化療可望為TNBC患者帶來臨床獲益。

在確?；煰熜У那疤嵯?，如何降低化療藥物的劑量，從而實(shí)現(xiàn)減少化療藥物的毒副反應(yīng)是我們需要解決的問題?；熢雒羰瞧渲幸环N可行的方法，其能夠在保證化療療效的前提下降低化療藥物的劑量和化療不良反應(yīng)，令維持化療成為可能。此外，增敏化療不僅能夠增強(qiáng)化療藥物的療效，而且可以減少因腫瘤細(xì)胞逃避化療而誘導(dǎo)繼發(fā)性耐藥的發(fā)生。

MSA是第2代有機(jī)硒小分子化合物，它對人體正常細(xì)胞影響很小，卻能高效地、選擇性地抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖[9]。在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)MSA不但具有抗腫瘤作用，聯(lián)合MSA和化療藥物還能夠提高化療藥物對前列腺癌的殺傷作用，表現(xiàn)出明顯的化療增敏作用。由于其抗腫瘤作用機(jī)制與傳統(tǒng)化療藥物不盡相同，聯(lián)合MSA與傳統(tǒng)化療藥物可能存在協(xié)同作用，有望成為化療藥物的增敏劑。

本研究結(jié)果顯示MSA聯(lián)合紫杉醇和阿霉素共同作用于TNBC細(xì)胞，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制率、死亡率均高于化療藥物單藥組。通過計算聯(lián)合藥物CI值，我們發(fā)現(xiàn)MSA與上述2種化療藥物聯(lián)合應(yīng)用存在協(xié)同作用。同時，在比較了小劑量化療藥物聯(lián)合MSA和大劑量化療藥物單藥對MDA-MB-231細(xì)胞的作用后，我們發(fā)現(xiàn)MSA聯(lián)合小劑量的化療藥物效應(yīng)基本接近甚至超過了單用大劑量化療藥物的作用，結(jié)果提示MSA能夠增強(qiáng)化療藥物的效果，即MSA聯(lián)合化療藥物能夠在保證療效的基礎(chǔ)上降低化療藥物劑量，達(dá)到化療增敏的效果。

大部分抗腫瘤藥物都有細(xì)胞周期阻滯作用，無論是S期還是G2/M期阻滯都使細(xì)胞在增殖分裂過程中易受到藥物干擾，導(dǎo)致分裂過程停滯。我們的實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫杉醇聯(lián)合MSA后使更多的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，而G2/M期是紫杉醇抗腫瘤作用的敏感周期，從而易化了紫杉醇結(jié)合微管蛋白過程，阻礙紡錘絲形成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10]，最終達(dá)到了增敏化療的效果。

另外，本研究通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示紫杉醇、阿霉素及MSA對TNBC細(xì)胞均有誘導(dǎo)凋亡作用，MSA聯(lián)合化療藥物組的凋亡率較單藥組及對照組均明顯增加。提示誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是MSA化療增敏的可能機(jī)制之一。

本研究證實(shí)了甲基硒酸能增強(qiáng)阿霉素、紫杉醇化療藥物對三陰乳腺癌細(xì)胞的抗腫瘤作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯效應(yīng)是其化療增敏可能機(jī)制之一。聯(lián)合MSA與化療藥物可望成為TNBC后續(xù)治療新的選擇。

[1] 邱萬壽，郝俊文，李 璽，等. 硒代胱氨酸對人三陰性乳腺癌細(xì)胞的抑制作用[J].中華實(shí)驗外科雜志，2012，29(10):1983-1985.

[2] Chen TF, Zheng WJ, Wong YS,et al. Mitochondria-me-diated apoptosis in human breast carcinoma MCF-7 cells induced by a novel selenadiazole derivative[J]. Biomed Pharmacother, 2008, 62(2):77-84.

[3] Hu H, Li GX, Wang L, et al. Methylseleninic acid enhances taxane drug efficacy against human prostate cancer and down-regulates antiapoptotic proteins Bcl-XL and survivin[J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(4):1150-1158.

[4] Cleator S, Heller W, Coombes RC. Triple negative breast cancer: therapeutic options[J]. Lancet Oncol, 2007, 8(3):235-244.

[5] 蔣光愉, 李 紅, 何偉麗, 等. 三陰型乳腺癌FOXA1和BRCA1的表達(dá)及其對預(yù)后的意義[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(7): 1230-1234.

[6] Rakha EA, Ellis IO. Triple-negative/basal-like breast cancer: review[J].Pathology, 2009, 41(1):40-47.

[7] Dent R, Trudeau M, Pritchard KI, et al. Triple negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence[J]. Clin Cancer Res, 2007, 13(15):4429-4434.

[8] Huang H, Jiang Z, Wang T, et al. Single-agent capeci-tabine maintenance therapy after response to capecitabine-based combination chemotherapy in patients with metasta-tic breast cancer[J]. Anticancer Drugs, 2012, 23(7):718-723.

[9] Hoefig CS, Renko K, K?hrle J, et al. Comparison of different selenocompounds with respect to nutritional valuevs. toxicity using liver cells in culture[J]. J Nutr Biochem, 2011, 22(10):945-955.

[10] Chintala S, Tóth K, Cao S, et al. Se-methylselenocysteine sensitizes hypoxic tumor cells to irinotecan by targeting hypoxia-inducible factor 1α[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2010, 66(5):899-911.

Sensitizationofchemotherapyforhumantriple-negativebreastcancercellsbymethylseleninicacid

QIU Wan-shou1, TANG Yong2, LIU Wei1, WU Jue-kun1, LI Xi1

(1BreastDiseaseCenter,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2DepartmentofGeneralSurgery,ChangshaCentralHospital,Changsha410004,China.E-mail:wsqiu-d@163.com)

AIM: To observe the chemosensitization effect of methylseleninic acid (MSA) on human triple-negative breast cancer (TNBC) cells.METHODSMDA-MB-231 cell line was co-cultured with MSA plus paclitaxel or doxorubicin. The inhibitory rate of cell proliferation was detected by CCK-8 assay. The combination index was calculated to explore the impact of MSA on the efficacy of chemotherapeutic drugs. The cell cycle was analyzed by flow cytometry. Annexin V-FITC/PI double staining was applied to detect the cell apoptosis.RESULTSCompared with single usage of chemotherapeutic drugs, the cell proliferation rates were decreased when the chemotherapeutic drugs was combined with MSA, suggesting that there is a synergistic relationship between MSA and chemotherapeutic drugs. Compared with the single-agent groups, the G2/M-phase cells in paclitaxel combined with MSA group increased significantly (P<0.05),and the S-phase cells increased significantly in doxorubicin combined with MSA group (P<0.05). These suggested that MSA enhanced the anticancer effect of the drugs by inducing cell cycle arrest. Compared with single usage of 10 nmol/L paclitaxel, the apoptotic rate increased from 41.1% to 59.3% (P<0.05) as 10 nmol/L paclitaxel combined with 3.5 μmol/L MSA was used. Compared with single usage of 0.5 μmol/L doxorubicin, the apoptotic rate increased from 30.2% to 51.9% (P<0.01) as 0.5 μmol/L doxorubicin combined with 3.5 μmol/L MSA was used. These suggested that MSA enhanced antitumor effect of the drugs by inducing tumor cell apoptosis.CONCLUSIONMSA enhances the antitumor effects of chemotherapeutic drugs doxorubicin and paclitaxel on TNBC cells. One of the possible mechanisms is the enhancement of inducing tumor cell apoptosis and cell cycle arrest.

Methylseleninic acid; Triple-negative breast cancer; Chemosensitization; Cell cycle arrest; Apoptosis

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.013

1000- 4718(2013)11- 1990- 04

2013- 08- 06

2013- 10- 08

廣東省科技計劃(No.2008B030301128)

△通訊作者 Tel: 020-85252154; E-mail： wsqiu-d@163.com