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    IFN-γ上調(diào)人胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá)*

    2013-10-24 06:29:15陳淑芬侯婧瑛吳淑云王凌云
    中國病理生理雜志 2013年11期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞株生存率胃癌

    陳淑芬, 侯婧瑛, 吳淑云, 王凌云△

    (中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 1消化內(nèi)科, 2急診科,廣東 廣州 510120)

    IFN-γ上調(diào)人胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá)*

    陳淑芬1, 侯婧瑛2, 吳淑云1, 王凌云1△

    (中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1消化內(nèi)科,2急診科,廣東 廣州 510120)

    目的研究不同人胃癌細(xì)胞株表面程序性死亡配體1(PD-L1)表達(dá)及干擾素γ(IFN-γ)對(duì)其表達(dá)的誘導(dǎo)情況。方法分別培養(yǎng)不同人胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901,經(jīng)不同濃度IFN-γ、作用不同時(shí)間后,利用流式細(xì)胞術(shù)及real-time PCR檢測胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1在蛋白和mRNA水平的表達(dá)情況。結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)顯示AGS、BGC823、MGC803和SGC7901細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)率分別為(1.567±0.109)%、(2.640±0.577)%、(1.760±0.236)%和(16.030±1.289)%;不同胃癌細(xì)胞株對(duì)IFN-γ反應(yīng)不同,經(jīng)不同濃度IFN-γ刺激后均可不同程度上調(diào)PD-L1的表達(dá)(P<0.05);real-time PCR顯示10 μg/L IFN-γ刺激各胃癌細(xì)胞株12 h后PD-L1 mRNA水平上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論胃癌細(xì)胞株組成性表達(dá)PD-L1;IFN-γ可上調(diào)胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1的表達(dá),呈現(xiàn)濃度、時(shí)間依賴性;其中以SGC7901細(xì)胞(來源于轉(zhuǎn)移淋巴結(jié))表達(dá)最高,推測胃癌細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)與腫瘤分化程度無關(guān),與組織來源和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān);IFN-γ上調(diào)胃癌細(xì)胞PD-L1,表明IFN-γ并非都是抑制腫瘤增殖、生長,可能參與介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸,故臨床運(yùn)用IFN-γ輔助治療胃癌時(shí)應(yīng)慎用。

    胃癌細(xì)胞; 程序性死亡配體1; 干擾素γ; 預(yù)后

    程序性死亡配體1(programmed death ligand 1, 簡稱PD-L1,又稱為B7-H1),是一種含有290個(gè)氨基酸的I型跨膜糖蛋白,于1997年被Dong等[1]從胎盤cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)。PD-L1蛋白廣泛表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞、活化T/B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、胎盤滋養(yǎng)層、心肌內(nèi)皮和胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞。在許多腫瘤組織亦有PD-L1蛋白的表達(dá),如宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌[2-3],且腫瘤組織中PD-L1的表達(dá)水平較癌旁組織明顯升高,與患者臨床預(yù)后緊密相關(guān)[1,4]。胃癌是常見且惡性程度較高的消化道惡性腫瘤,手術(shù)是首選治療方法,然而術(shù)后患者預(yù)后差,5年總生存率僅約30%~50%,術(shù)后聯(lián)合免疫治療和/或化療方案有著較為肯定的療效。干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)因其具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)免疫功能的作用而廣泛用于腫瘤治療。近年研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞、胰腺癌PD-L1表達(dá)[2,5]。目前國內(nèi)外關(guān)于胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá)及IFN-γ對(duì)其表達(dá)影響的研究及報(bào)道較少。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析不同胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá),并探討IFN-γ能否上調(diào)不同胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá),以期為胃癌的綜合治療方案提供依據(jù)。

    材 料 和 方 法

    1材料

    胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901均由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院黃開紅教授惠贈(zèng);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和RPMI-1640培養(yǎng)基均購于HyClone;IFN-γ購于Peprotech;PE標(biāo)記抗人PD-L1抗體和PE標(biāo)記小鼠IgG1同型抗體均購于eBioscience。Trizol和TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix 均購于寶生生物公司,SsoAdvancedTMSYBR Green Supermix購于華南地區(qū)Bio-Rad總代理;FACS流式細(xì)胞儀為BD產(chǎn)品。CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為Bio-Rad產(chǎn)品。

    2方法

    2.1不同濃度IFN-γ對(duì)胃癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響 待體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞處于生長對(duì)數(shù)期時(shí),消化制成細(xì)胞懸液,調(diào)整密度為1×108/L,接種于24孔板培養(yǎng)24 h,分別加入不同濃度IFN-γ(0 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L和80 μg/L),繼續(xù)培養(yǎng)24 h收獲細(xì)胞。每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次。

    2.2IFN-γ刺激不同胃癌細(xì)胞株不同時(shí)點(diǎn)PD-L1表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期胃癌細(xì)胞,接種于24孔板,實(shí)驗(yàn)組加10 μg/L[5-6]IFN-γ,分別培養(yǎng)不同時(shí)間(0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和72 h),每個(gè)時(shí)點(diǎn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,收獲各時(shí)段細(xì)胞。重復(fù)3次。

    2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測 收集上述處理細(xì)胞,0.02%EDTA消化,離心,1 000 r/min 5 min,PBS(含1%FBS)洗滌2次;PBS(含1%FBS)重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L;各吸取100 μL細(xì)胞懸液,分為2管,分別加入PE標(biāo)記小鼠IgG1和PE標(biāo)記鼠抗人 PD-L1抗體1 μL,混勻置于4 ℃避光孵育30 min,2 mL PBS洗滌1次,300 μL PBS重懸,上機(jī)檢測。

    2.4Real-time PCR 細(xì)胞懸液接種于6孔板,10 μg/L IFN-γ干預(yù)12 h,據(jù)TaKaRa Total RNA說明書提取總RNA,-80℃保存;按TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix 說明書合成cDNA, -20℃保存;引物設(shè)計(jì)合成由Life Invitrogen 公司完成。β-actin正義序列5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’,反義序列5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’;PD-L1正義序列 5’-GGACAAGCAGTGACCATCAAG-3’,反義序列5’-CCCAGAATTACCAAGTGAGTCCT-3’。按照Bio-Rad SsoAdvancedTMSYBR Green Supermix說明書實(shí)驗(yàn)。體系為20 μL,取2 μL cDNA產(chǎn)物分別與PD-L1引物和β-actin引物進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,重復(fù)40次循環(huán)。Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀操作反應(yīng)。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔCt。

    3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 16.0軟件分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn);多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),組間多重比較采用Bonferroni法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901均表達(dá)PD-L1

    流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示不同胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901均不同程度表達(dá)PD-L1(與標(biāo)記同型抗體的胃癌細(xì)胞株相互比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,均P<0.05);其中以SGC7901表達(dá)最高[(16.030±1.289)%],余依次為BGC823、MGC803和AGS,見圖1。

    2胃癌細(xì)胞經(jīng)IFN-γ刺激后呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性上調(diào)PD-L1蛋白表達(dá)

    流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證實(shí)胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901均可經(jīng)不同濃度IFN-γ刺激后上調(diào)PD-L1,并呈現(xiàn)劑量依賴性:隨著IFN-γ濃度升高,PD-L1蛋白表達(dá)呈現(xiàn)增高趨勢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2;在10 μg/L IFN-γ刺激不同時(shí)間后,不同胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)上升趨勢,48 h達(dá)高峰,72 h后開始下降,其中BGC823、MGC803和SGC7901表達(dá)與0 h比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖3。不同胃癌細(xì)胞株對(duì)IFN-γ的反應(yīng)敏感性不同,以BGC823和SGC7901較為敏感,低濃度(5 μg/L和10 μg/L)IFN-γ即可上調(diào)PD-L1表達(dá)(P<0.05),而細(xì)胞株AGS和MGC803則需要中濃度(40 μg/L)和高濃度(80 μg/L)IFN-γ上調(diào)PD-L1表達(dá)(P<0.05),見圖2。

    Figure 1. PD-L1 surface expression in four different human gastric cancer cell lines analysed by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsisotype control.

    圖1不同胃癌細(xì)胞株表面PD-L1的表達(dá)

    Figure 2. Dose-dependent surface expression of PD-L1 in human gastric cancer cells induced by IFN-γ. AGS,BGC823, MGC803 and SGC7901 cells were treated with diffenrent concentrations of IFN-γ for 24 h. PD-L1 surface expression was analysed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μg/L.

    圖2不同濃度IFN-γ對(duì)不同胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá)的影響

    Figure 3. Time-dependent surface expression of PD-L1 in human gastric cancer cells induced by IFN-γ. Human gastric cancer cell lines AGS,BGC823,MGC803 and SGC7901 were treated with IFN-γ (10 μg/L) for diffenrent time. PD-L1 surface expression was analysed by flow cytometry.Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 h.

    圖3IFN-γ作用不同時(shí)間對(duì)不同胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá)的影響

    3IFN-γ上調(diào)胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1mRNA表達(dá)

    Real-time PCR結(jié)果顯示10 μg/L IFN-γ刺激胃癌細(xì)胞12 h,各種胃癌細(xì)胞PD-L1 mRNA水平均上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中以SGC7901細(xì)胞最明顯,見圖4。

    討 論

    胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,根治性手術(shù)是治療的首選方法,但術(shù)后復(fù)發(fā)率高,預(yù)后差。據(jù)調(diào)查,我國胃癌的發(fā)病率及死亡率均高于世界水平[7]。提高生存率,改善患者預(yù)后具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)陽性的胃癌患者其1年、3年生存率均低于表達(dá)陰性者,術(shù)后PD-L1可明顯下降,而復(fù)發(fā)時(shí)升高[3]。高表達(dá)PD-L1的腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯升高,無病生存率及總生存率均明顯低于PD-L1陰性或低表達(dá)者[4]。故目前PD-L1已被公認(rèn)可作為評(píng)估腫瘤患者預(yù)后的獨(dú)立因素[4,8-9]。我們前期通過免疫組化發(fā)現(xiàn)胃癌組織表達(dá)PD-L1,PD-L1表達(dá)陽性者與表達(dá)陰性組的1年生存率上未見明顯差異,而3年生存率存在差異性,表達(dá)陽性組較陰性組3年生存率相對(duì)較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(未發(fā)表)。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)及RT-PCR技術(shù)分別從蛋白及mRNA水平檢測各胃癌細(xì)胞株中PD-L1表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901均組成性表達(dá)PD-L1。實(shí)驗(yàn)選用不同分化程度、不同來源的胃癌細(xì)胞系(AGS和BGC823均為低分化胃腺癌,MGC803為低分化胃黏液腺癌,SGC7901為中分化胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶),以SGC7901細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)最高,考慮可能與其來源于胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié),而PD-L1高表達(dá)于活化淋巴細(xì)胞有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PD-L1的表達(dá)水平與腫瘤的分化程度無直接關(guān)系,而可能與胃癌細(xì)胞組織來源及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

    Figure 4. PD-L1 relative mRNA expression stimulated with IFN-γ in four different gastric cancer cell lines. The gastric cancer cell lines AGS,BGC823,MGC803 and SGC7901 were treated with IFN-γ (10 μg/L)for 12 h. The relative expression of PD-L1 mRNA was analysed by real-time PCR.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

    圖4IFN-γ刺激不同胃癌細(xì)胞株前后PD-L1mRNA相對(duì)表達(dá)量

    在胃癌進(jìn)展過程中,IFN-γ逐漸減少,甚至難以檢測[10],因此我們推測IFN-γ下降與胃癌分期有關(guān)。焦付豐等[11]亦發(fā)現(xiàn)胃癌患者IFN-γ較正常對(duì)照組分泌減少;劉曉玲等[12]研究證實(shí)胃癌化療后部分緩解的患者IFN-γ較化療前升高。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證明IFN-γ能抑制腫瘤生長及腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,并在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用,故IFN-γ被廣泛用于臨床抗腫瘤治療。本實(shí)驗(yàn)首先運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)持續(xù)IFN-γ刺激可上調(diào)胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1蛋白的表達(dá);且不同胃癌細(xì)胞對(duì)上調(diào)PD-L1蛋白所需IFN-γ刺激濃度、時(shí)間不一,考慮可能與細(xì)胞對(duì)IFN-γ敏感程度差異有關(guān)[13];為了進(jìn)一步探討IFN-γ在mRNA水平對(duì)PD-L1誘導(dǎo)情況,我們選用文獻(xiàn)中常用的IFN-γ濃度(10 μg/L)刺激胃癌細(xì)胞,利用real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)IFN-γ刺激胃癌細(xì)胞后,PD-L1 mRNA表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前導(dǎo)致IFN-γ上調(diào)PD-L1表達(dá)的機(jī)制尚不明確,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在PD-L1啟動(dòng)子區(qū)域含有數(shù)個(gè)IFN-γ反應(yīng)元件[6,14],我們從mRNA及蛋白水平均發(fā)現(xiàn)經(jīng)IFN-γ處理后胃癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)升高,故推測IFN-γ可能在PD-L1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平發(fā)揮作用,從而上調(diào)其在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)。但PD-L1具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

    本實(shí)驗(yàn)證明IFN-γ可上調(diào)胃癌細(xì)胞PD-L1表達(dá), 而腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1,能降低其自身免疫原性,促使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫系統(tǒng)攻擊[14],表明IFN-γ并非都是抑制腫瘤增殖、生長,可能一定程度上促進(jìn)腫瘤免疫逃逸[5],所以臨床上運(yùn)用IFN-γ治療腫瘤時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎。

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    Interferon-γup-regulatesprogrammeddeathligand1inhumangastriccancercells

    CHEN Shu-fen1, HOU Jing-ying2, WU Shu-yun1, WANG Ling-yun1

    (1DepartmentofGastroenterology,2EmergencyDepartment,SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:xzr020@aliyun.com)

    AIM: To study the expression of programmed death ligand 1 (PD-L1) in human gastric cancer cells with or without the stimulation of interferon-γ (IFN-γ).METHODSThe protein levels of PD-L1 in 4 different human gastric cancer cell lines AGS, BGC823, MGC803 and SGC7901 with or without IFN-γ treatment were analyzed by flow cytometry. The mRNA expression of PD-L1 in those cell lines was also detected by real-time PCR.RESULTSFlow cytometry analysis showed that the rates of PD-L1 surface expression in the 4 human gastric cancer cell lines AGS, BGC823, MGC803 and SGC7901 were (1.567±0.109)%, (2.640±0.577)%, (1.760±0.236)% and (16.030±1.289)%, respectively. After the 4 gastric cancer cell lines were treated with IFN-γ at different concentrations or for different time, the PD-L1 surface expression increased at different levels with significant differences between groups. Real-time PCR also indicated that IFN-γ up-regulated PD-L1 expression at mRNA level.CONCLUSIONPD-L1 surface expression is found in human gastric cancer cell lines AGS, BGC823, MGC803 and SGC7901. IFN-γ up-regulates the expression of PD-L1. SGC7901 cell line, which is from metastatic lymph nodes, expresses the highest protein level of PD-L1 among the 4 cell lines, indicating that PD-L1 expression may be related to lymph node metastasis, not to differentiation grade. IFN-γ may mediate the tumor immune escape so that it should be carefully applied in the treatment of gastric cancer.

    Gastric cancer cells; Programmed death ligand 1; Interferon-γ; Prognosis

    R363

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.006

    1000- 4718(2013)11- 1952- 05

    2013- 08- 20

    2013- 10- 02

    廣東省科技社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(No. 2012B031800362)

    △通訊作者 Tel:020-81332489;E-mail:xzr020@aliyun.com

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