正交設(shè)計優(yōu)化唇形科植物ITS反應(yīng)體系

沈文華，陳 業(yè)，李婭迪，江 輝，關(guān) 萍

(貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025)

唇形科(Lamiaceae)是雙子葉植物綱中的一個大科，大約有220屬3 500余種，中國約有98屬800余種，全國廣布;貴州有47屬127種［1］。中國唇形科藥用植物共有74屬345余種，其中《中藥大辭典》收錄的共41屬120余種［2］，常見的唇形科藥用植物有益母草、牛至、夏枯草、筋骨草、藿香、紫蘇、薄荷、荊芥、黃芩等［3］。唇形科植物只有在花果期時才便于鑒定，且屬內(nèi)不同種相似性較大，種質(zhì)鑒定極其不易，作為藥材時，經(jīng)常有奸商將偽品魚目混珠［4］。DNA條形碼(DNA barcoding)作為一種快速、有效而標準化的分子鑒定方法，由加拿大U-niversity of Guelph動物學家Paul Hebert首次提出［5］。Kress等［6］最早將 ITS 作為植物 DNA 條形碼候選片段，目前已有在七葉一枝花［7］、柴胡［8］、黃草石斛［9］等中藥材方面的研究。本文對常見唇形科植物ITS-PCR反應(yīng)體系進行了優(yōu)化，旨在為唇形科藥用植物的分子鑒定奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的16種唇形科植物均于2012年6月至9月采于貴陽市花溪區(qū)，由貴州大學生命科學學院關(guān)萍教授鑒定(表現(xiàn)1)。

1.2 基因組DNA的提取與檢測

采用改良的CTAB法［10］提取全基因組DNA，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，通過紫外分光光度計確定DNA濃度與純度，并將濃度稀釋至20～80 ng/μL。

表1 研究材料Tab.1 The materials used for PCR reaction system optimization

1.3 正交設(shè)計與各反應(yīng)因素水平確定

益母草nrDNA ITS片段的擴增采用通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和 ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)［11］。以益母草DNA為模板，選用L9(34)正交表(表2)，對Taq聚合酶、Mg2+、dNTP及引物的濃度進行篩選。反應(yīng)體系總體積為25μL，每管加入2.5μL的10×PCR buffer和1μL模板DNA，加去離子水補足，每組處理重復兩次。

表2 PCR正交試驗設(shè)計表［L 9(34)］Tab.2 Orthogonal design for PCR amplification

PCR擴增反應(yīng)在Bio-Rad梯度PCR擴增儀上進行，反應(yīng)程序為:94℃ 4 min;94℃ 1 min;54℃45 s;72℃ 1 min;35次循環(huán);72℃最后延伸7 min，擴增完成后4℃保存。用1.5%的瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)成像。

依據(jù)桂騰琴等［12］的方法對PCR擴增結(jié)果依次打分，采用正交設(shè)計助手ⅡV3.1與MINITAB軟件對試驗進行直觀分析與分差分析，依據(jù)方差分析的結(jié)果確定是否需要進行多重比較分析。

根據(jù)試驗分析結(jié)果，選擇最佳反應(yīng)體系對退火溫度進行梯度試驗，設(shè)定 50.0、50.7、51.9、53.6、55.6、57.2、58.4、59.0℃8 個溫度梯度，每個梯度設(shè)兩個重復，最后用最佳反應(yīng)體系與程序?qū)?6種唇形科植物進行ITS-PCR穩(wěn)定性驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS－PCR正交設(shè)計直觀分析

正交試驗PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。綜合考慮兩次重復的擴增結(jié)果，條帶最清晰、穩(wěn)定的組合計9分，最差的計1分，9個組合的分數(shù)依次為3、4、8、5、6、9、2、1、7，再根據(jù)打分，采用正交設(shè)計助手ⅡV3.1進行直觀分析(表3)。極差值R反應(yīng)了影響因素對反應(yīng)體系的影響，R越大，影響越顯著。由表3可知，各因素水平的變化對反應(yīng)體系的影響從大到小依次為:Mg2+＞Taq＞dNTP＞引物。

圖1 正交試驗PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of orthogonal design PCR products The codes of lane

表3 正交設(shè)計直觀分析Tab.3 Intuitive analysis of orthogonal design

依據(jù)每個因素水平下的均值ki，直觀分析得出的最佳反應(yīng)體系為:1.5 U Taq聚合酶;2.0 mmol/L Mg2+;0.15 ～0.20 mmol/L dNTP;引物濃度為 0.4 μmol/L。直觀分析得出的最佳反應(yīng)體系并沒有在正交表中表現(xiàn)出，雖然與得分最高的6號組合在引物用量上有差別，但其ki值相差并不是很大。

2.2 正交設(shè)計方差分析

用正交設(shè)計助手ⅡV3.1軟件對試驗結(jié)果進行方差分析(表4)。由F比值可知，Mg2+濃度各水平對PCR結(jié)果的影響最大，其次是Taq聚合酶用量，而dNTP與引物量對PCR結(jié)果影響不明顯。

表4 正交設(shè)計方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal design

用MINITAB軟件對試驗結(jié)果進行多重比較分析(圖2)，結(jié)果表明，Mg2+濃度對該試驗結(jié)果的影響最大。Mg2+濃度在 1.0、1.5 mmol/L 水平間的差異不明顯，但與2.0 mmol/L水平的差異顯著(圖2)。圖 1 中，當 Mg2+濃度為1.0 mmol/L(1、4、7 號處理)時和1.5 mmol/L(2、5、8 號處理)時，臨近處理號PCR產(chǎn)物條帶相似，擴增條帶弱、有雜帶，且彌散、拖尾;當 Mg2+濃度為 2.0 mmol/L(3、6、9 號處理)時，擴增條帶亮度清晰、明亮，無雜帶，彌散與拖尾現(xiàn)象減弱或者消失。因此，選擇2.0 mmol/L為最佳水平。

Taq聚合酶用量對PCR結(jié)果的影響僅次于Mg2+用量，各水平間均有顯著差異，說明在本試驗所選梯度范圍內(nèi)Taq聚合酶用量對PCR反應(yīng)結(jié)果影響較大，最佳用量為1.5 U。

dNTP濃度在該試驗選取的3個水平范圍內(nèi)對PCR擴增結(jié)果影響不顯著，這一結(jié)論與馬大龍等［13］的研究相似，參照ki值以及從經(jīng)濟角度考慮，最佳dNTP濃度為0.15 mmol/L。

在本試驗所選的3個水平范圍內(nèi)，引物濃度對PCR擴增結(jié)果的影響也不顯著，這與陳業(yè)等［14］的研究相似，參照每一因素水平下的數(shù)據(jù)平均值ki，最佳引物濃度為1.0μmol/L。

圖2 各因素與實驗結(jié)果主效應(yīng)圖Fig.2 The main effect pattern of each factor and experiment result

2.3 退火溫度對益母草ITS－PCR擴增的影響

根據(jù)正交試驗結(jié)果，選擇的反應(yīng)體系為:1.5 U Taq 聚合酶，2.0 mmol/L Mg2+，0.15 mmol/L dNTP，0.4μmol/L引物。依據(jù)引物Tm值，以此體系進行溫度梯度試驗(圖3)。由圖3可見，退火溫度較高時(55.6、57.2、58.4、59℃)，擴增條帶較弱，且雜帶較多;退火溫度較低時(50℃)，擴增條帶雖然清晰、明亮，但主帶附近有1條明顯的雜帶;退火溫度50.7～53.6℃都能擴增出單一明亮的條帶。由于適當提高退火溫度可提高擴增產(chǎn)物的特異性，故選擇53.6℃為最佳退火溫度。

圖3 退火溫度對ITS反應(yīng)的影響Fig.3 The effect of annealing temperature on ITSamplification Lane 1 to 8 indicating the annealing temperature

2.4 最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的驗證

根據(jù)正交試驗及溫度梯度擴增試驗結(jié)果，對唇形科16種植物進行反應(yīng)體系的驗證。反應(yīng)程序為:第一階段，94℃預(yù)變性4 min;第二階段，94℃變性 1 min，53.6℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，循環(huán) 35次;第三階段，72℃延伸7 min，反應(yīng)終止，4℃保存。PCR擴增后進行電泳檢測出現(xiàn)清晰、明亮的單一譜帶(圖4)，產(chǎn)物經(jīng)上海生工測序，除10以外都獲得了ITS序列。

圖4 16種常見唇形科植物ITS擴增結(jié)果Fig.4 Electrophoresis of 16 common lamiaceae PCR products

3 討論

已有研究報道［10-12］表明，PCR反應(yīng)對模板濃度要求范圍較寬，故本試驗未對模板濃度進行探究。試驗結(jié)果表明，在ITS擴增反應(yīng)體系中，Taq聚合酶、Mg2+對擴增結(jié)果有重要影響，而dNTP、引物濃度對擴增結(jié)果的影響不明顯。在PCR反應(yīng)體系中，Mg2+濃度過高，會使反應(yīng)特異性降低，濃度過低，使產(chǎn)物產(chǎn)量減少;Taq聚合酶濃度太高，會出現(xiàn)非特異性擴增，而過低時則擴增產(chǎn)量太低。同時，為增加試驗的可比性，應(yīng)盡量選擇同一產(chǎn)家同一批次的Taq聚合酶。dNTP與引物濃度對PCR擴增結(jié)果都有影響，dNTP濃度過低影響擴增產(chǎn)量，過高則會導致錯誤摻入，而引物濃度過高則有兩個弊端:一是容易形成引物二聚體，二是微量靶目標并且起始材料又不太純時容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。本試驗dNTP與引物濃度的3個水平對擴增結(jié)果影響不明顯，僅表明這3個水平對本試驗的影響。因此，不同植物初建ITS-PCR體系時，要保證擴增結(jié)果的穩(wěn)定性、可信性、重復性，必須對ITS擴增的條件與因素進行優(yōu)化。

本試驗將正交設(shè)計應(yīng)用于PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化中，并在結(jié)果分析中應(yīng)用了正交設(shè)計助手、MINITAB軟件。與單因素設(shè)計和完全組合設(shè)計相比具有以下優(yōu)勢:減少了處理組合，節(jié)省了人力財力;將結(jié)果量化，使結(jié)果更標準、完善、科學，具有一定的客觀準確性;試驗中各因素內(nèi)水平間的相關(guān)性分析結(jié)合圖表，其規(guī)律一目了然。本試驗中對正交試驗結(jié)果打分帶有一定的主觀性，打分結(jié)果可能出現(xiàn)因人而異的情況，因此，可采取多次打分取平均值的方法以削弱誤差的影響，同時需建立一套客觀、標準的評價準則。

本試驗獲得的最佳反應(yīng)體系經(jīng)過論證，可以為后續(xù)唇形科植物ITS-PCR反應(yīng)提供參考。對于樣品10，可以適當提高Mg2+濃度，或者結(jié)合單因素試驗對Mg2+濃度進行優(yōu)化，以獲得ITS序列。

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