酶法分離純化豬血血紅素的工藝及應用研究進展

龐美霞，綦菁華，王 芳，黃漫青，王 偉

(1.北京農學院食品科學與工程學院，北京 102206;2.石家莊衛(wèi)生學校，河北石家莊 050061)

豬血是一種可以大量獲得的營養(yǎng)價值很高的工業(yè)副產品，其中蛋白質含量18.9%，比雞蛋高6.2%，比大米高12.7%，因此豬血被人們譽為“液態(tài)肉”［1］。豬血由血細胞和血漿兩部分組成，血漿蛋白含量約占全血蛋白含量的25%，血漿蛋白容易制取，可通過離心、干燥制得，因此被廣泛用于肉類、布丁、香腸等食品中。而血細胞蛋白—主要是血紅蛋白，由于色澤猩紅，具有腥味和不易消化，應用受到限制［2］。

我國每年的生豬產量居世界第一，占世界生豬產量的一半，豬血資源非常豐富，每年獲得的血量在90萬t以上［2］，但目前僅用來制造飼料用血粉及血豆腐、血餅等附加值較低的產品，因此對豬血的利用很低。很多豬血被直接排放入環(huán)境中，造成環(huán)境污染。我國從20世紀80年代開始研究豬血的綜合利用，目前文獻報道了利用豬血開發(fā)血紅素、蛋白粉、凝血酶和超氧化物岐化酶(SOD)的研究［3-4］。

血紅素是含鐵卟啉化合物，具有重要的生理功能，應用廣泛。目前血紅素的提取方法主要是有機試劑法，既污染環(huán)境，毒性也大，因此國內外一直在研究新的血紅素提取方法。近年來，很多人利用酶技術提取畜禽血液中的血紅素。從豬血中酶法提取血紅素，將會產生較好的經(jīng)濟效益和社會效益［5］。

1 血紅素、血紅蛋白的結構特征和性質

血紅素是動物肌肉和血液中的主要色素，在肌肉中主要以肌紅蛋白(myoglobin，Mb)形式存在，在血液中主要以血紅蛋白(hemoglobin，Hb)形式存在。血紅蛋白是由兩條α－球蛋白多肽鏈和兩條β－球蛋白多肽鏈組成的四聚體，因此具有四級結構，由四個亞基組成。每個亞基由一條多肽鏈與一個血紅素相連接，4個亞基之間由鹽鍵連接。肌紅蛋白是只有三級結構的單鏈蛋白質，與血紅蛋白各亞基結構極為相似。血紅蛋白和肌紅蛋白均是典型的攜氧蛋白［6］。

血紅素是一種亞鐵卟啉化合物。四個吡咯環(huán)由四個α-碳原子通過四個次甲基(—CH=)橋相連形成卟吩環(huán)，F(xiàn)e2+位于環(huán)中，與吡咯環(huán)上的氮原子結合成四個配位鍵，從而形成亞鐵卟啉環(huán)，血紅素分子式為C34H33FeN4O4，分子量為633.49。亞鐵原子與球蛋白分子組氨酸殘基上的咪唑環(huán)上的氮原子形成第五個配位鍵，與各種配基的電負性原子結合形成第六個配位鍵。血紅素及血紅蛋白結構見圖1。血紅素為片狀或針狀的紫色結晶，不溶于水、稀酸、醚、氯仿及丙酮，溶于氫氧化鈉水溶液、熱或氨水中［7，8］。血紅蛋白溶解性好，有很強的乳化能力，并能形成穩(wěn)定的泡沫。

2 血紅素制備工藝

目前工業(yè)中主要利用有機溶劑法生產血紅素(包括冰醋酸法和酸性丙酮法)［9］。冰醋酸法是血液與冰醋酸及少量NaCl，KCl等共熱得到血紅素結晶。此法收率低，1升血液只可得3—4 g血紅素結晶，提取溫度高，蛋白和溶劑難回收［10］。酸性丙酮法是根據(jù)血紅素與珠蛋白在pH3.0附近結合最疏松的原理分離血紅素的。加入鹽酸丙酮溶液，血紅素與珠蛋白脫離，亞鐵血紅素變成氯化血紅素且溶于酸性丙酮中，珠蛋白變性沉淀。根據(jù)后序工藝不同酸性丙酮法可分為醋酸鈉法、蒸餾法、稀堿抽提法、鞣酸鹽析法［9］。

圖1 只有主鏈骨架而沒有側鏈的血紅蛋白的二級結構

此外近些年在實驗室還有人用CMC法、表面活性劑法、酶解法等方法制備血紅素。CMC法是利用CMC吸附血紅素與血紅蛋白分離的。表面活性劑法是在鹽酸酸化的血紅蛋白中加入表面活性劑，加熱，氯化血紅素沉淀出來［9］。利用蛋白酶提取血紅素是最環(huán)保的一種方法。

3 蛋白酶法制備血紅素工藝研究進展

3.1 原理及工藝流程

在新鮮血液中添加抗凝劑，離心分離得到紅細胞，破碎紅細胞，用各種蛋白酶在其最適條件下將血紅蛋白上的珠蛋白水解，肽鏈斷開，水解液中有血紅素肽、血紅素和肽片段，除去不需要的肽，得到血紅素復合體。以動物血液作原料，將紅細胞用大量水稀釋，調pH，用蛋白酶進行水解，將珠蛋白和血紅素分離［9，11］，工藝流程見圖 2。

圖2 酶法制備血紅素工藝

3.2 蛋白酶的選擇及血紅素酶法提取工藝研究進展

用于水解蛋白質的酶按來源分有三種:植物蛋白酶(如菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶)、動物蛋白酶(如胰蛋白酶)和微生物蛋白酶。目前在我國酶法提取血紅素還處于實驗室研究階段。選出成本低廉的蛋白酶，采用最簡單的方法制備血紅素是研究的熱點。

瞿桂香等［12］研究了4種蛋白酶，以血紅素提取率為考察指標，按影響程度從大到小的順序是堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶。張亞娟［11］分別選用6種酶以及復合酶水解血紅蛋白，然后用三氯乙酸沉淀四肽以上片段，再測定上清液280 nm下的吸光度值，吸光值大小反應蛋白質的水解率，通過此方法確定堿性蛋白酶的水解能力最強，其次是中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，風味酶，復合酶水解效果也較好，但低于堿性蛋白酶。楊錫洪等［13］先加中性蛋白酶，再加風味蛋白酶制備了亞鐵血紅素肽。楊萍等［14］用木瓜蛋白酶和AS1398中性蛋白酶復配生產補血活性肽。張純麗［2］用木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶=6∶4制備血紅素肽。

3.3 血紅素純化方法

血紅素純化的方法一般采用有機溶劑重復提取法或硅膠柱純化［15，16］，但這些方法生產成本高，且污染環(huán)境。現(xiàn)在有實驗室研究用超濾，酸化，凝膠層析等方法純化血紅素酶提取液。

周淡宜，徐水祥［17］利用血紅素不溶于水和醋酸的特性，將堿性提取液酸化，血紅素析出，然后經(jīng)過過濾、干燥得純品。張亞娟［11］將酶解液用鹽酸調pH至4.0，4 000 rpm/min離心15分來純化血紅素，所得粗品純度23%。楊錫洪等［13］將水解產物經(jīng)10 kDa微孔濾膜超濾后，濾過液再經(jīng)3 kDa濾膜超濾，收集第二次的滯留液，主要得到分子量分布為9982、6918和3951三個組分，制得亞鐵血紅素與肽的比值為9.92%的富亞鐵血紅素肽。

李艷偉［18］將胰蛋白酶水解的酶解液反復超濾后，通過Sephadex G－25凝膠層析、陽離子交換層析制得抗菌肽。

3.4 前處理——破碎紅細胞

酶解前必須破碎紅細胞。目前已發(fā)展了多種細胞破碎方法，主要分為機械法和非機械法兩大類。機械法有高壓勻漿破碎法、高速攪拌珠研磨破碎法、超聲波破碎法等;非機械法主要有滲透壓沖擊破碎法、凍融破碎法、酶溶破碎法、利用酸、堿、表面活性劑和有機溶劑的化學破碎法。豬血酶法提取血紅素目前主要是加水溶脹紅細胞和超聲波破胞。

楊錫洪等［13］加紅細胞3倍體積的蒸餾水，攪拌下溶脹破壁。真空脫氣，避光條件下60℃加熱30 min，3 000 r/min離心15 min，去除變性的雜蛋白等，得到血紅蛋白溶液。劉振榮等［19］首次將超聲波技術用于丙酮法提取氯化血紅素，加水量為離心后紅細胞體積的1/5，超聲波溶血時間為10 min，提取時間為15 min。王長瑞等［20］用超聲波酶法提取血紅素，最佳工藝條件為紅細胞與水的比例5∶1，破碎功率 185.34 W，時間8.76 min。

3.5 酶解中注意的問題——亞鐵離子的保護

酶解中血紅素亞鐵離子易被氧化成高鐵離子［21］，血紅蛋白液由紅色變?yōu)楹稚?。因此，在酶解時要加入適量的抗氧化劑來保護亞鐵血紅素，從而得到色澤理想的亞鐵血紅素肽。李芳等［22］研究乙氧喹和Vc對血紅素標準品的抗氧化效果，結果表明乙氧喹在實驗初期對亞鐵血紅素有良好的抗氧化性能，而Vc則具有持久的抗氧化性能，Vc/乙氧喹復合型抗氧化劑具有明顯優(yōu)于單一型抗氧化劑的抗氧化性能。楊錫洪等［13］酶解后，經(jīng)過真空脫氣、充氮，并添加茶多酚和異抗壞血酸鈉保護亞鐵離子。

4 酶解肽的功能及應用

4.1 血紅素肽的功能及應用［23］

血紅素鐵可預防和改善營養(yǎng)性貧血。因此可將血紅素肽添加到餅干、巧克力、糖果、面包、醬油等食品中作營養(yǎng)強化劑。

血紅素也是一種天然色素，添加在肉類食品中可作發(fā)色劑。在火腿、灌腸、午餐肉等肉制品中加入血紅素肽，可取代亞硝酸鹽及人工合成色素，使肉制品產生鮮艷紅色，增加食品的安全性。

在醫(yī)藥工業(yè)，血紅素是半合成法制備膽紅素的前體，而膽紅素是制備人工牛黃和抗癌藥的重要原料。

4.2 血紅蛋白多肽的功能

目前從食品蛋白質的酶解物中發(fā)現(xiàn)了一些小分子肽，包括抗高血壓肽、免疫調節(jié)肽、抗血栓肽、抗菌肽、抗癌肽，活性肽的開發(fā)是功能性食品研究最活躍的領域之一。Kazue等酶解豬血紅蛋白得到了4種具有抑制ACE活性，降血壓的活性肽［24］。張艷梅等將血紅蛋白酶解液脫色，經(jīng)Sephadex G-100凝膠層析純化，提取到了抗菌肽。方俊等［25］試驗結果表明豬血多肽具有較強的抗氧化作用。

5 結束語

酶解法制備血紅素是血紅素提取的發(fā)展方向，但是此法尚未成熟，血紅素的氧化以及溶解性問題需進一步實驗研究。篩選出成本低廉的蛋白酶，建立簡單易行，成本低，適合工業(yè)化生產的血紅素提取、純化方法，尋找合適的抗氧化劑或還原劑以及改善其溶解性等是需要解決的問題。

［1］車振明.豬血的綜合開發(fā)和利用［J］.農牧產品開發(fā)，2000，3(4):86 －90.

［2］張純麗.酶解豬血紅蛋白制備小肽粉方法的研究［D］.長沙:湖南農業(yè)大學，2007.

［3］馮詠梅，王文華，陳小平.豬血制品的研究與開發(fā)［J］.食品研究與開發(fā)，2002，6:71 －73.

［4］徐功華，陶李明，徐瑾.超濾法從豬血中提取凝血酶［J］.湘南學院學報，2006，8(1):73 －74.

［5］馬美湖.試論畜禽血液綜合利用的重要意義［J］.農牧產品開發(fā)，1996，12:28 －30.

［6］秦豪杰.珠蛋白研究進展及其在法醫(yī)學中的應用［J］.中國法醫(yī)學雜，2008，23(4):250 －252.

［7］王璋，許時嬰，湯堅.食品化學［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1999:280－281.

［8］闞建全.食品化學［M］.北京:中國農業(yè)大學出版社，2002:281－282.

［9］瞿桂香，黃耀江，董明盛.血紅素制備工藝研究進展［J］.中央民族大學學報(自然科學版)，2007，16(1):19 －22.

［10］王君，陳紅亮，張向東.氯化血紅素提取新工藝的研究［J］.當代化工，2000，30(3):125 －127.

［11］張亞娟.從豬血中酶法制取血紅素的研究［D］.無錫:江南大學，2007.

［12］瞿桂香，董明盛，黃耀江.不同蛋白酶水解豬血紅蛋白制備血紅素的對比研究［J］.江西農業(yè)學報，2007，19(7):92 －93.

［13］楊錫洪，夏文水.酶法水解血紅蛋白制備亞鐵血紅素肽［J］.食品與機械，2005，21(3):14－16.

［14］楊萍，常青，劉玉花.酶法生產補血活性肽［J］.食品研究與開發(fā)，2009，30(9)46 －49.

［15］劉亞麗，郭莉莉，羅貴民，等.亞血紅素的合成和純化方法的改進［J］.吉林大學自然科學學報，2001，26(1):91.

［16］WolfHU， Link H， Lang W， etal.Preparation，purification and characterization of chlorohaemin［J］.Biol Chem Hoppe Seyler，1992，373(6):305.

［17］周淡宜，徐水祥.血紅素純化技術研究及質量檢［J］.中國現(xiàn)代應用藥學雜志，2005，22(2):129－131.

［18］李艷偉，江波，佟祥山，酶解豬血蛋白中活性肽的純化和功能研究［J］.高等學?；瘜W學報，2005，26(1):61－63.

［19］劉振榮，王君，張向東，等.超聲波法提取氯化血紅素的初步研究［J］.遼寧大學學報(自然科學版)，2003，30(4):373 －377.

［20］王長瑞，于長青，王立東，等.超聲波酶法制備血紅素工藝條件的研究［J］.黑龍江八一農墾大學學報，2008，20(4):67 －71.

［21］石曉東，路秀玲.血紅蛋白在膜分離過程中的氧化規(guī)律和抗氧化探索［J］.過程工程學報，2005，5(6):659 －663.

［22］李芳，井淑波.抗氧化劑作用于血紅素亞鐵的抗氧化性能研究［J］.食品科技.2008，10:132－134.

［23］汪學榮，王飛.生物態(tài)補鐵劑一血紅素鐵研究進展［J］.糧食與油脂.2007，7:40 －43.

［24］張艷梅，佘銳萍，劉天龍，等.豬血中抗菌肽類物質的分離純化和抗菌活性研究［J］.科技導報2008，26(2)33 －37.

［25］方俊，盧向陽，莫瑾，等.豬血蛋白多肽對小鼠抗氧化功能的影響［J］.Acta Nutrimenta Sinica，2006，28(6):534 －535.