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    向日葵下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化影響因素的研究

    2013-10-22 04:23:32劉海臣
    關(guān)鍵詞:潮霉素胚軸共培養(yǎng)

    劉海臣

    (內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼 028042)

    向日葵屬于菊科一年生草本植物,具有耐鹽堿、抗干早、耐貧瘠等優(yōu)良特性,是植物油脂和蛋白質(zhì)的重要來源,同時(shí),它也是重要的生物能源之一。向日葵很容易受農(nóng)桿菌侵染[1],所以目的基因很容易通過農(nóng)桿菌進(jìn)入向日葵的腫瘤細(xì)胞。向日葵遺傳工程獲得首例轉(zhuǎn)化植株報(bào)道的是利用下胚軸經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的未知序列基因的轉(zhuǎn)化[2],并且是用卡那霉素作為再生植株的篩選標(biāo)記。在向日葵遺傳轉(zhuǎn)化過程中,一些研究表明:利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化向日葵受許多因素影響。這些因素包括外植體的生理年齡[3]、外植體的接種時(shí)間[4,5]、農(nóng)桿菌株[6]、共培養(yǎng)時(shí)間[3]、培養(yǎng)基中激素種類及濃度[7]、篩選劑的類型及濃度[8,9]和不同的遺傳轉(zhuǎn)化方法[10,11]。

    本試驗(yàn)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,研究了共培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間、重懸液濃度等因素對(duì)向日葵下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 植物材料與轉(zhuǎn)化受體

    HA300、NC208、諾雜212三種基因型均由內(nèi)蒙古通遼市種子公司提供,以向日葵下胚軸為轉(zhuǎn)化受體。

    1.1.2 質(zhì)粒和菌株

    根癌農(nóng)桿菌EHA101由本實(shí)驗(yàn)室保存,質(zhì)粒 (本室構(gòu)建)上含有目的基因Psy和植物抗性篩選標(biāo)記Hpt基因。

    1.1.3 向日葵組織培養(yǎng)及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基

    向日葵下胚軸組織培養(yǎng)及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基,其成分見表1。

    表1 向日葵下胚軸組織培養(yǎng)及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基

    1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.2.1 潮霉素適宜篩選濃度試驗(yàn)

    將3個(gè)向日葵品種的下胚軸作為外植體,接種到含潮霉素分別為0、5、10、15、20mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng),每一梯度每一品種接種外植體數(shù)10,各4次重復(fù)。2~3周后調(diào)查下胚軸的分化情況。

    1.2.2 影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化因素試驗(yàn)

    實(shí)驗(yàn)中設(shè)置共培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間、農(nóng)桿菌菌液濃度和干燥時(shí)間4個(gè)因子試驗(yàn),共培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置5個(gè)處理 (1、2、3、4、5d);侵染時(shí)間設(shè)5個(gè)梯度 (1、5、10、15、20min);農(nóng)桿菌菌液濃度A600值分別為0.3、0.6、0.9、1.2;干燥處理時(shí)間為0、4、8h,干燥處理方法:將切割好的下胚軸放置在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中,在工作臺(tái)里放置,讓其自然干燥。以上每一梯度接種外植體數(shù)為48個(gè)。

    1.2.3 試驗(yàn)結(jié)果的調(diào)查與數(shù)據(jù)處理

    外植體接種到含不同濃度的Hyg培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周后調(diào)查下胚軸的芽誘導(dǎo)情況,并統(tǒng)計(jì)不定芽率,不定芽率 (%)=發(fā)生不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100;侵染的外植體在脫菌篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)2~3周后,調(diào)查產(chǎn)生抗性芽的外植體數(shù),計(jì)算抗性芽誘導(dǎo)率,抗性芽誘導(dǎo)率 (%)=抗性芽的外植體數(shù)/侵染的外植體數(shù)×100;抗性芽誘導(dǎo)率用SSPS(13.0版本)軟件進(jìn)行方差分析與顯著性測(cè)驗(yàn)。

    1.3 植物材料的培養(yǎng)

    取3個(gè)品種向日葵的種子,挑選粒大飽滿的在超凈工作臺(tái)上先用75%酒精浸泡1~2min,無菌水沖洗1~2次,然后用無菌水浸泡12h,再用0.1%升汞溶液浸泡10min,用無菌水沖洗3~4次,然后取出向日葵籽仁接種到發(fā)芽培養(yǎng)基上,于25℃、無光照條件下培養(yǎng)。當(dāng)苗齡2~3d左右時(shí),取無菌苗的下胚軸作為外植體用于轉(zhuǎn)化。

    1.4 脫菌篩選培養(yǎng)

    共培養(yǎng)3d后,將向日葵下胚軸轉(zhuǎn)移到脫菌篩選培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)抗性芽的產(chǎn)生。每天光照16h,溫度25℃,每15~20d天繼代一次,頭孢霉素濃度由300mg/L逐漸降低,以抑制住農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)為宜。篩選壓Hyg濃度由高到低,10~5mg/L。培養(yǎng)時(shí)以未作轉(zhuǎn)化的材料為對(duì)照。由于具有Hyg抗性的下胚軸在篩選培養(yǎng)基上能正常生長(zhǎng),并且在下胚軸處分化出綠色芽,而非抗性的小芽逐漸黃化、死亡。

    1.5 抗性植株P(guān)CR檢測(cè)

    PCR擴(kuò)增的引物分別為:引物1:5'—GAA TTC ATG TCT ATT TGT ACG CTA TGG GTT GTT—3',引物2:5'—GC GGC CGC TCA TGT TTG GGG TAT CAT AAA AGA—3'。按王關(guān)林的SDS方法提取植物基因組DNA,分別從抗性植株和未轉(zhuǎn)化對(duì)照植株葉片提取DNA作為模板,按94℃預(yù)變性3min;94℃變性1min;61℃退火1min;72℃延伸1min。重復(fù)30個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸11min的程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增,質(zhì)粒為陽性對(duì)照,未轉(zhuǎn)化對(duì)照植株DNA為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系為25μL,模板DNA為1μL。擴(kuò)增結(jié)束后,取5μL PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 篩選劑潮霉素濃度的確定

    從圖1可以看出,3種基因型(HA300、NC208和諾雜212)向日葵下胚軸對(duì)潮霉素的敏感性相似,均隨著潮霉素濃度的增加,出芽率呈下降趨勢(shì)。無潮霉素時(shí)芽的誘導(dǎo)率為68.9%,而當(dāng)加入不同濃度的潮霉素后對(duì)向日葵下胚軸芽的誘導(dǎo)卻有明顯的抑制作用,當(dāng)潮霉素濃度為15mg/L時(shí),不定芽誘導(dǎo)率降為1.97%,且外植體開始變白、變褐并萎縮。對(duì)不同潮霉素濃度和向日葵品種的出芽率進(jìn)行了方差分析可知,下胚軸出芽率在潮霉素的不同濃度處理間存在極顯著差異 (F=247.2>F0.01=7.01)。10mg/L潮霉素時(shí),下胚軸出芽率極顯著地低于對(duì)照,基本上完全抑制不定芽形成。因此,在遺傳轉(zhuǎn)化時(shí),以10mg/L潮霉素作為選擇壓力。

    圖1 不同潮霉素濃度對(duì)向日葵下胚軸誘導(dǎo)率的影響

    2.2 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抗性芽率的影響

    圖2 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)向日葵子葉節(jié)抗性芽率的影響

    農(nóng)桿菌侵染下胚軸后共培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可知,共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)下胚軸抗性芽率的影響存在顯著差異,共培養(yǎng)時(shí)間3d的較1d的抗性芽率HA300提高了11.0%、諾雜212提高了7.8%、NC208提高了7.6%,3d的較5d的抗性芽率HA300 高 11.5%、 諾 雜 212 高11.0%、NC208高9.3%,且5個(gè)處理以共培養(yǎng)時(shí)間3d的抗性芽率最高。因此,確定向日葵下胚軸農(nóng)桿菌侵染后適宜的共培養(yǎng)時(shí)間為3d。

    2.3 侵染時(shí)間對(duì)向日葵抗性芽誘導(dǎo)率的影響

    在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中,菌液的浸染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化有一定的影響。農(nóng)桿菌侵染時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果 (圖3)表明,農(nóng)桿菌對(duì)HA300、NC208和諾雜212向日葵的下胚軸的侵染時(shí)間不同,下胚軸抗性芽率也存在差異,3個(gè)品種下胚軸的侵染時(shí)間以10min的抗性芽率最高,且顯著地高于1min和20min兩個(gè)處理。因此,確定農(nóng)桿菌侵染下胚軸的較適宜時(shí)間為10min。

    圖3 侵染時(shí)間對(duì)抗性芽率的影響

    2.4 重懸液的濃度對(duì)抗性芽的影響

    以A600為0.3、0.6、0.9和1.2五種濃度的重懸液分別侵染向日葵HA300、NC208和諾雜212的下胚軸,5周之后調(diào)查抗性芽率 (圖4)。由圖4可知,當(dāng)菌液濃度達(dá)到0.6時(shí),抗性芽率最高,隨著重懸液濃度的增加抗性芽率而減少。對(duì)不同重懸液濃度進(jìn)行方差分析結(jié)果表明,不同重懸液間的抗性芽率存在極顯著差異 (F=12.53>F0.01=4.76),但重懸液濃度A600為0.6和0.9之間的下胚軸抗性芽率差異不顯著。在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),當(dāng)重懸液濃度增加時(shí),雖然侵染機(jī)率很大,但是下一步抑菌工作帶來很大困難,而且對(duì)植物細(xì)胞的傷害也很大,導(dǎo)致相當(dāng)一部分細(xì)胞褐化、失去再生能力或死亡。因此我們選擇A600為0.6為侵染時(shí)所用重懸液濃度。

    2.5 外植體干燥處理對(duì)抗性芽率的影響

    細(xì)胞滲透壓的改變可以影響轉(zhuǎn)化效果,研究者通過添加甘露醇或山梨醇來改變植物細(xì)胞的滲透壓,來提高轉(zhuǎn)化效率。但通過對(duì)外植體干燥處理還未見報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)侵染的向日葵下胚軸進(jìn)行了4h和8h的干燥處理(圖5)。由圖5可知,向日葵品種HA300和NC208下胚軸4h干燥處理的抗性芽率,較不處理分別提高11.8%和19.6%,較8h處理分別高6.7%和10.7%,說明對(duì)預(yù)侵染的下胚軸進(jìn)行適當(dāng)?shù)母稍锾幚碛兄诳剐匝柯实奶岣摺?/p>

    圖4 農(nóng)桿菌重懸菌液濃度對(duì)抗性芽率的影響

    2.6 抗性苗的PCR檢測(cè)

    從抗性植株和未轉(zhuǎn)化對(duì)照植株葉片提取總DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,未轉(zhuǎn)化苗為陰性對(duì)照,質(zhì)粒為陽性對(duì)照,以λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ 雙酶切DNA分子為標(biāo)準(zhǔn)分子量,電泳結(jié)果見圖6。圖6表明,轉(zhuǎn)基因苗和質(zhì)粒都在1.3kb附近擴(kuò)增出特異條帶,而陰性對(duì)照苗卻未擴(kuò)增出相應(yīng)的特異條帶,由此初步證實(shí),目的基因Psy已轉(zhuǎn)入到向日葵中。本試驗(yàn)共獲得向日葵抗性苗126株,經(jīng)PCR檢測(cè)得到4株轉(zhuǎn)基因向日葵苗,轉(zhuǎn)化率為3.2%。NC208得到1株,HA300得到3株,諾雜212未得到轉(zhuǎn)化株。

    圖5 干燥時(shí)間對(duì)向日葵下胚軸抗性芽率的影響

    3 討 論

    3.1 篩選劑對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的影響

    遺傳轉(zhuǎn)化過程中,重要的一個(gè)環(huán)節(jié)是受體的抗性篩選。通過篩選那些未轉(zhuǎn)化的受體就會(huì)死亡,而已轉(zhuǎn)化的受體因有抗性而存活下來。一般的做法是,在繼代時(shí)去掉褐化或死亡的外植體,但我們?cè)谙蛉湛屡咻S抗性篩選時(shí)發(fā)現(xiàn),抗性芽不但從綠色的愈傷組織上長(zhǎng)出芽,而且會(huì)從褐化非常嚴(yán)重、看上去死亡的愈傷組織上長(zhǎng)出,而這些芽很有可能發(fā)育成抗性的苗。這可能是由于轉(zhuǎn)化首先是對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,而不是組織;表現(xiàn)褐化的愈傷組織,是大多數(shù)的細(xì)胞死亡了,而個(gè)別抗性細(xì)胞仍還活著,只是被大量的褐化細(xì)胞包圍而難于生長(zhǎng)。一旦去掉篩選劑,這些抗性細(xì)胞便進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育,進(jìn)而分化成苗。因此,褐化的下胚軸不要過早地丟棄。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,不同的基因型對(duì)潮霉素的敏感性確實(shí)存在差別,潮霉素使用濃度為10mg/L最佳。此外,潮霉素的使用方式如篩選壓濃度宜由低到高還是由高到低,仍需進(jìn)一步探索。

    圖6 向日葵下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化的PCR檢測(cè)

    3.2 共培養(yǎng)時(shí)間與侵染時(shí)間對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的影響

    向日葵下胚軸作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體,由于下胚軸是器官組織,且表面積較小,農(nóng)桿菌侵染時(shí)不易接觸到傷口細(xì)胞。因此,所需的侵染時(shí)間比其它組織,如愈傷、體細(xì)胞胚組織等要長(zhǎng)。在本試驗(yàn)確定10min為農(nóng)桿菌侵染下胚軸的較適宜時(shí)間。

    農(nóng)桿菌對(duì)植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí),必須在傷口部位存活16h以上,才能進(jìn)行T-DNA的轉(zhuǎn)移。此期間涉及農(nóng)桿菌向受傷部位的附著,Vir區(qū)基因的誘導(dǎo)活化及T-DNA的轉(zhuǎn)移整合。因此,需要較長(zhǎng)的共培養(yǎng)時(shí)間,但在實(shí)際操作中,共培養(yǎng)時(shí)間也不宜太長(zhǎng),如果共培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng),農(nóng)桿菌過度生長(zhǎng),不僅造成脫菌困難,還會(huì)使下胚軸受到毒害,不定芽形成困難或褐化死亡。本試驗(yàn)確定向日葵下胚軸農(nóng)桿菌侵染的共培養(yǎng)時(shí)間為3d。

    3.3 外植體干燥處理對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的影響

    細(xì)胞滲透壓的改變可以影響轉(zhuǎn)化效果,研究者通過添加甘露醇或山梨醇來改變植物細(xì)胞的滲透壓,來提高轉(zhuǎn)化效率。本研究試圖通過對(duì)下胚軸干燥處理來改變細(xì)胞的滲透壓,進(jìn)而提高抗性芽率。試驗(yàn)表明,對(duì)下胚軸進(jìn)行適當(dāng)?shù)母稍锾幚碛欣诳剐匝柯实奶岣?。以干燥處?h的下胚軸為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,下胚軸抗性芽率較不處理有明顯的提高。

    4 小 結(jié)

    建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的向日葵下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化體系,適宜的菌液濃度A600為0.6、侵染時(shí)間為10min、共培養(yǎng)時(shí)間為3d、篩選劑潮霉素的濃度為10mg/L,下胚軸干燥處理時(shí)間4h有利于向日葵的遺傳轉(zhuǎn)化。

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