大鼠胃潰瘍自愈期間胃黏膜EGF mRNA、EGFR mRNA的表達(dá)

馬義騰，張 靜，吳靖芳，寇金慶，張江蘭，張 耕

（1.河北北方學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)本科2010級(jí)2班，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，河北 張家口 075000；3.河北北方學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)本科2010級(jí)1班，河北 張家口 075000）

胃潰瘍的形成及愈合涉及到胃黏膜侵襲因素與黏膜、自身防御－修復(fù)因素，而表皮生長(zhǎng)因子 （epider-mal growth factor，EGF）是一種具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化的重要生物活性肽，在維持黏膜完整性方面具有重要作用，它通過(guò)與細(xì)胞表面的受體 （epidermal growth factor receptor，EGFR）結(jié)合而發(fā)揮作用［1］。二者在基因水平的表達(dá)是其在蛋白水平發(fā)揮功能的基礎(chǔ)，因此我們建立大鼠胃潰瘍模型，通過(guò)采用半定量轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng) （reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測(cè)大鼠胃黏膜EGF mRNA、EGFR mRNA在胃潰瘍自愈期間的表達(dá)情況，探討二者在胃黏膜修復(fù)中的意義及半定量RT-PCR法用于此項(xiàng)檢測(cè)的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

Redzol、DEPC購(gòu)自北京賽百盛生物工程有限公司，dNTP Mix、DL2000，Goldview、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，RNase抑制劑購(gòu)自Gene Copoeia公司；2×Taq PCR體系購(gòu)自北京盛旭百川生物工程公司，引物由北京賽百盛生物工程有限公司合成。

1.2 動(dòng)物模型建立

8周齡雄性SD大鼠 （購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）共36只，體質(zhì)量 （180～230）g。分為潰瘍組和正常組。潰瘍組在胃體前壁近胃竇處注射0.01mL冰乙酸制備胃潰瘍模型；正常組不做處理。潰瘍組分別于制成模型后1、4、6、10、14d（每組6只）取材，正常組 （6只）與潰瘍1d組同時(shí)取材。取材前各組動(dòng)物禁食12h，經(jīng)3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，迅速開(kāi)胸取胃，取潰瘍旁胃組織及正常組近胃竇胃組織約100mg經(jīng)DEPC水清洗后迅速置于液氮中以備RT-PCR檢測(cè)。

1.3 RT-PCR檢測(cè)EGF、EGFR mRNA的表達(dá)

①提取胃黏膜總RNA：100mg組織剪碎，加入1mL Redzol充分研磨，將裂解液移入到1.5mL EP管中，室溫放置5min。加200μL氯仿，劇烈搖動(dòng)30s，室溫3min，12 000r·min－1（4℃）離心15 min。取上層無(wú)色水相移入另一EP管中，加等體積異丙醇，室溫下放置10min，12 000r·min－1（4℃）離心15min。管底部可見(jiàn)白色RNA沉淀。棄上清，加1mL 75%乙醇洗滌，7 500r·min－1（4℃）離心5 min，棄上清，室溫干燥5～10min后溶于一定量DEPC水中，保存于-70℃超低溫冰箱中；②RNA完整性檢測(cè)：5μL RNA加1μL上樣緩沖液在1.5%瓊脂糖中電泳，用UVP GELDOC-IT凝膠成像系統(tǒng)觀察；③RNA純度及濃度測(cè)定：DEPC水按一定比例稀釋后RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)分別測(cè)量260、280nm的吸光度值，根據(jù)比值檢測(cè)RNA純度，同時(shí)根據(jù)260nm吸光度值 （absorbance，A），計(jì)算每組RNA濃度，并進(jìn)行調(diào)整，使其保持一致；④反轉(zhuǎn)錄：反應(yīng)總體系20μL，其中總RNA 2.5μL，隨機(jī)引物1μL，M-MLV 1μL，dNTPs 2μL，RNase抑制劑1μL；⑤PCR擴(kuò)增反應(yīng)：總體系20μL，其中cDNA 2μL，EGF引物序列為：上游5′-GCCAAGCTCAGAAGGCTAC-3′，下游5′-CAGGCCAGCCTCGTCTCAT-3′，擴(kuò)增條件94℃30s，54℃30s，72℃1min，循環(huán)35次，產(chǎn)物361bp；EGFR引物序列為：上游5′－TCGGTGCTGTGCGATTTA-3′，下游5′-TTTCTGGCAGTTGCTCCTC-3′，擴(kuò)增條件94℃30s，53℃30s，72℃1min，循環(huán)35次，產(chǎn)物194bp；GAPDH引物序列為：上游5′-CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT-3′，下游5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，擴(kuò)增條件94℃30s，58℃30s，72℃1min，循環(huán)35次，產(chǎn)物595bp。PCR產(chǎn)物測(cè)定及分析：PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖中電泳，用UVP GELDOCIT凝膠成像系統(tǒng)觀察。

1.4 圖像觀察與半定量分析

用凝膠成像系統(tǒng)觀察并檢測(cè)EGF、EGFR擴(kuò)增產(chǎn)物與GAPDH的吸光度 （A）值，根據(jù)EGF、EGFR與GAPDH的吸光度比值對(duì)其進(jìn)行半定量分析。數(shù)據(jù)均用 （±s）表示，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠胃潰瘍模型的建立

胃潰瘍術(shù)后1d，大鼠胃前壁即可見(jiàn)邊界清楚的潰瘍形成，周圍黏膜隆起 （圖1）；4、6d組潰瘍更為明顯，隨后潰瘍逐漸縮小，部分愈合。

2.2 RT-PCR檢測(cè)大鼠胃組織EGF mRNA、EGFR mRNA的表達(dá)

所提取的mRNA完整性良好 （圖2），28srRNA和18srRNA條帶清楚并完整，無(wú)拖帶和污染。A260／A280比值在1.8～2.0之間，其純度良好。EGF mRNA （圖3A）、EGFR mRNA （圖3B）、GAPDH（圖3C）擴(kuò)增產(chǎn)物分別是250～500bp、100～250bp、500～750bp的一條清晰擴(kuò)增帶，結(jié)果顯示EGF mRNA、EGFR mRNA在術(shù)后表達(dá)逐漸增強(qiáng)，二者分別在潰瘍10d、潰瘍6d組表達(dá)最強(qiáng)，之后稍減弱（表1，圖4）。

表1 大鼠胃黏膜EGF／GAPDH mRNA、EGFR／GAPDH mRNA OD比值（±s）

表1 大鼠胃黏膜EGF／GAPDH mRNA、EGFR／GAPDH mRNA OD比值（±s）

注：與正常組相比：▲P＜0.01；與前一潰瘍組相比：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

正常組 潰瘍1d 潰瘍4d 潰瘍6d 潰瘍10d 潰瘍14d EGF 0.80±0.13 1.10±0.04▲ 1.68±0.06▲＊＊ 1.73±0.14▲ 1.99±0.10▲＊＊ 1.68±0.05▲＊＊EGFR 0.83±0.04 1.44±0.13▲＊＊ 1.53±0.13▲ 1.69±0.10▲＊ 1.49±0.15▲＊＊ 1.37±0.10▲

圖1 大鼠胃潰瘍術(shù)后1d胃粘膜潰瘍形成 （→）

圖2 大鼠胃黏膜總RNA電泳圖

圖3 RT-PCR法測(cè)得的EGF mRNA （4A），EGFR mRNA （4B），GAPDH mRNA （4C）的結(jié)果 M：Marker；N：正常組；1、4、6、10、14分別代表1、4、6、10、14d潰瘍組。

圖4 大鼠胃黏膜EGF／GAPDH mRNA、EGFR／GAPDH mRNA A比值

3 討 論

胃潰瘍是消化道常見(jiàn)的疾病，且有5%的胃潰瘍能發(fā)生惡變，潰瘍后黏膜的修復(fù)過(guò)程關(guān)系到疾病的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，研究表明潰瘍的愈合質(zhì)量與EGF及EGFR的表達(dá)密切相關(guān)［2］。EGF是重要的黏膜修復(fù)因子，是生長(zhǎng)因子家族中第一個(gè)發(fā)揮作用的［3］，它與靶細(xì)胞上的受體EGFR結(jié)合后，激活EGFR-ERK信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［4］。EGF能夠抑制胃酸分泌，促進(jìn)上皮細(xì)胞增生，在保護(hù)胃黏膜免受損傷因子的破壞，維持黏膜完整性方面起到重要的作用［5］。EGFR是具有酪氨酸激酶活性的一種跨膜糖蛋白受體，與EGF具有較高的特異性親合力［6］，能傳遞EGF家族的生物學(xué)活性并使其完全表達(dá)，并可提高損傷部位旁EGFR數(shù)目，從而促進(jìn)損傷黏膜上皮的修復(fù)［7］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠胃潰瘍自愈期間胃黏膜能夠內(nèi)源性地表達(dá)EGF mRNA及EGFR mRNA，并在潰瘍后黏膜愈合早期、中期呈現(xiàn)漸增趨勢(shì)，在愈合晚期略有下降，兩種因子的表達(dá)規(guī)律與胃潰瘍的愈合是一致的，并與我們課題組在檢測(cè)兩種因子蛋白水平的變化趨勢(shì)也是一致的［8］，兩種因子在基因水平的表達(dá)是決定其在蛋白翻譯水平發(fā)揮功能的基礎(chǔ)。研究表明，EGFR是早期反應(yīng)基因，出現(xiàn)時(shí)間早于中間反應(yīng)基因EGF［9］，我們實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示在潰瘍術(shù)后1d，EGFR mRNA表達(dá)即增強(qiáng)，至術(shù)后6d表達(dá)最強(qiáng)，EGF mRNA于術(shù)后4d增強(qiáng)較為明顯，術(shù)后10d表達(dá)最強(qiáng)，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道一致。

本實(shí)驗(yàn)中，我們采用半定量RT-PCR法檢測(cè)EGF mRNA和EGFR mRNA的表達(dá)，RT-PCR法是近幾年常用的一種檢測(cè)RNA的技術(shù)方法，將mRNA先反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以推測(cè)各樣品中特異mRNA的相對(duì)含量。實(shí)時(shí)定量PCR法雖能精確計(jì)算基因表達(dá)量，但減少了擴(kuò)增后電泳的檢測(cè)步驟，因此不能監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小；同時(shí)此方法實(shí)驗(yàn)成本較高也限制了其廣泛的應(yīng)用。而半定量RT-PCR法對(duì)試驗(yàn)條件的要求不高，方便快捷，一般實(shí)驗(yàn)室即能開(kāi)展，其主要特點(diǎn)是選一個(gè)表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因（β-actin或GAPDH）作為比較標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)得到的待測(cè)基因與內(nèi)參基因條帶吸光度比值，來(lái)分析各實(shí)驗(yàn)組RNA的含量［10］。此方法能消除實(shí)驗(yàn)中的誤差，采用的是相對(duì)值而不是絕對(duì)值，在比較各實(shí)驗(yàn)組樣品之間mRNA的表達(dá)差異時(shí)能夠足以說(shuō)明問(wèn)題，因此在各個(gè)研究領(lǐng)域都有著非常廣泛的應(yīng)用。RT-PCR實(shí)驗(yàn)成功與否與實(shí)驗(yàn)操作關(guān)系密切。在提取總RNA時(shí)要嚴(yán)格防止RNA酶污染，組織盡可能碾碎，并充分與RNA抽提試劑混合，以獲得足量的RNA。吸取氯仿離心后上層含RNA的水相時(shí)應(yīng)遵循寧少勿多的原則，避免吸入中間層的DNA和下層的蛋白質(zhì)。同時(shí)要對(duì)RNA進(jìn)行純度分析，紫外光下觀察凝膠電泳后RNA，一般會(huì)出現(xiàn)28S、18S2條帶，而且28S條帶的亮度是18S的2倍時(shí)，表明RNA的完整性較好。紫外分光光度計(jì)測(cè)量A260／A280的值在1.8～2.0之間時(shí)，說(shuō)明純度比較高，如果比值低，說(shuō)明有蛋白質(zhì)污染，而比值高說(shuō)明RNA已水解成單核酸了。在進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈時(shí)一般可應(yīng)用試劑盒，需要注意的是要對(duì)各樣本的RNA濃度進(jìn)行調(diào)整，通過(guò)A260值計(jì)算出濃度，統(tǒng)一調(diào)整至各組RNA濃度一致，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。進(jìn)行半定量PCR反應(yīng)時(shí)要選擇合適的內(nèi)參，β-actin或GAPDH均可。半定量RT-PCR技術(shù)是利用產(chǎn)物與模板的線性關(guān)系，來(lái)檢測(cè)總RNA中目的基因的表達(dá)。但是如果循環(huán)數(shù)較多，擴(kuò)增反應(yīng)會(huì)隨著酶活性下降和反應(yīng)物的消耗進(jìn)入平臺(tái)期。在平臺(tái)期的擴(kuò)增使低水平表達(dá)的目的RNA可能會(huì)增加，產(chǎn)生非特異性，因此要經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)選擇合適的循環(huán)數(shù)。退火溫度也是PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是引物和模板結(jié)合時(shí)的溫度參數(shù)，是影響PCR特異性的較重要因素。退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合，因此可通過(guò)PCR儀梯度設(shè)置退火溫度選擇最為合適的條件，建立優(yōu)化的PCR體系。

我們實(shí)驗(yàn)表明胃黏膜在胃潰瘍愈合的過(guò)程中可自身產(chǎn)生EGF mRNA和EGFR mRNA，二者在基因水平上的表達(dá)直接影響蛋白水平功能的發(fā)揮，在胃潰瘍愈合過(guò)程中起到了促進(jìn)的作用，同時(shí)半定量RT-PCR法在檢測(cè)基因表達(dá)水平方面是一個(gè)強(qiáng)有力的研究手段，但在關(guān)鍵環(huán)節(jié)中要加以注意，才能得到可靠準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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