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    microRNA-101和環(huán)氧合酶-2在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義*

    2013-10-22 12:10:48何曉璞丁清清許海塵薛綺萍孫為豪
    胃腸病學(xué) 2013年11期
    關(guān)鍵詞:負(fù)相關(guān)結(jié)腸癌調(diào)控

    邵 耘 何曉璞 丁清清 許海塵 薛綺萍 孫為豪

    南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年消化科(210029)

    MicroRNAs(miRNAs)是一類(lèi)長(zhǎng)度為21~25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA。成熟miRNAs作為基因調(diào)控因子,通過(guò)與靶基因mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)堿基序列互補(bǔ)結(jié)合,使靶mRNA降解或抑制其翻譯,從而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控靶基因表達(dá)[1,2]。近年研究發(fā)現(xiàn) miRNAs在多種人類(lèi)惡性腫瘤中表達(dá)異常,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起癌基因或抑癌基因作用,并有望應(yīng)用于惡性腫瘤的診斷和治療[3,4]。miR-101 是新近發(fā)現(xiàn)的一種 miRNA,在肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、胃癌等多種惡性腫瘤中呈低表達(dá),而過(guò)表達(dá)外源性miR-101可發(fā)揮腫瘤抑制作用[5~8]。

    胃癌是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命的常見(jiàn)惡性腫瘤之一,在癌癥發(fā)病和死因中均居前列。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)行為,也是影響治療效果和預(yù)后的關(guān)鍵因素。本課題組前期研究顯示環(huán)氧合酶-2(COX-2)過(guò)表達(dá)在胃癌腫瘤血管生成中起重要作用,并與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)[9],而特異性COX-2抑制劑能有效抑制胃癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。關(guān)于胃癌組織中COX-2異常表達(dá)的分子機(jī)制,包括轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制,目前尚未完全明確。有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌及其肝轉(zhuǎn)移灶和結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-101表達(dá)下調(diào)而COX-2表達(dá)上調(diào),兩者呈顯著負(fù)相關(guān)[11],體外實(shí)驗(yàn)表明miR-101可與COX-2 mRNA的3’-UTR結(jié)合,直接抑制結(jié)腸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞中 COX-2 的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)[11,12],提示COX-2為miR-101的直接靶基因,腫瘤細(xì)胞中miR-101低表達(dá)可能為COX-2過(guò)表達(dá)的主要原因之一。對(duì)胃癌的研究[7]亦發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-101表達(dá)可通過(guò)靶向EZH2、COX-2、Mcl-1和Fos基因抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力,但關(guān)注miR-101、COX-2表達(dá)與胃癌臨床病理特征相關(guān)性的文獻(xiàn)報(bào)道不多。本研究以實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測(cè)胃癌組織和配對(duì)癌旁非癌組織中的miR-101、COX-2 mRNA表達(dá),通過(guò)分析兩者間以及兩者與胃癌主要臨床病理特征的關(guān)系,探討miR-101和COX-2在胃癌診斷、治療中的臨床意義。

    材料與方法

    一、標(biāo)本來(lái)源

    收集2010年3~12月于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科行手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的新鮮胃癌標(biāo)本30例,其中男23例,女7例,年齡41~85歲,中位年齡55歲。患者術(shù)前均未接受過(guò)非甾體消炎藥治療、化療、放療以及其他針對(duì)腫瘤的治療,臨床和病理資料完整。每例標(biāo)本留取腫瘤組織和距腫瘤邊緣5 cm以上、經(jīng)病理檢查證實(shí)不含癌細(xì)胞的胃黏膜組織,離體后10 min內(nèi)液氮速凍,-70℃保存?zhèn)溆谩Q芯糠桨附?jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者本人或法定代理人簽署知情同意書(shū)。

    二、主要試劑和儀器

    TRIzol?Reagent(Ambion?,Life Technologies Corporation),TaqMan?miRNA ABC Purification Kit、TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan?Gold RT-PCR Kit、7500 Real-Time PCR System(Applied Biosystems?, Life Technologies Corporation),High CapacityRNA-to-cDNA Kit、Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG with ROX(InvitrogenTM,Life Technologies Corporation)。

    三、方法

    1.miRNA提取:取50 mg組織,以TRIzol?試劑勻漿,參照TaqMan?miRNA ABC純化試劑盒說(shuō)明書(shū)提取miRNA,收集含miRNA的洗脫液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.總 RNA提取:取50 mg組織,參照 TRIzol?試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA,DEPC處理水溶解RNA,紫外分光光度法測(cè)定總RNA A260、A280值,計(jì)算RNA濃度,根據(jù) A260/A280比值檢測(cè)其純度,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    3.qRT-PCR檢測(cè)miR-101、COX-2 mRNA表達(dá)

    ①miR-101:參照TaqMan?MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。參照TaqMan?Gold RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系總體積20 μL,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s,60℃退火60 s,60℃延伸60 s,共40個(gè)循環(huán)。以?xún)?nèi)參照U6表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

    ②COX-2 mRNA:參照 High Capacity RNA-tocDNA試劑盒說(shuō)明書(shū)合成 cDNA。參照 Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG with ROX說(shuō)明書(shū)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系總體積25 μL,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min;95℃變性10 s,60℃退火30 s,70℃延伸45 s,共40個(gè)循環(huán)。以?xún)?nèi)參照GAPDH表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

    PCR引物序列見(jiàn)表1。以2-△△Ct法分析目的基因相對(duì)表達(dá)量。

    表1 PCR引物序列

    四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、miR-101、COX-2 mRNA 表達(dá)

    絕大多數(shù)胃癌組織中miR-101表達(dá)低下,COX-2 mRNA則呈過(guò)表達(dá);相反,除少數(shù)病例外,癌旁組織miR-101表達(dá)均明顯高于相應(yīng)癌組織,COX-2 mRNA則呈低表達(dá)甚至不表達(dá)(見(jiàn)圖1)。miR-101在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁組織,COX-2 mRNA在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織,組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;同一組織中的miR-101與COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量之間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表2)。

    表2 胃癌組織與癌旁組織miR-101、COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較()

    表2 胃癌組織與癌旁組織miR-101、COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較()

    *與癌旁組織比較,P <0.01;▲與同組 COX-2 mRNA 比較,P <0.01

    二、miR-101與COX-2 mRNA在胃癌組織和癌旁組織中表達(dá)的相關(guān)性

    根據(jù)Person相關(guān)系數(shù),胃癌組織與癌旁組織中的miR-101與COX-2 mRNA表達(dá)均呈顯著負(fù)相關(guān)(癌組織:r= -0.767,P=0.000;癌旁組織:r=-0.718,P=0.000)。

    三、miR-101、COX-2 mRNA表達(dá)與胃癌主要臨床病理特征的關(guān)系

    胃癌組織中的miR-101、COX-2 mRNA表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān),與患者性別、年齡以及腫瘤部位、組織學(xué)類(lèi)型、分化程度均無(wú)相關(guān)性(見(jiàn)表3)。伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌miR-101表達(dá)顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例,COX-2 mRNA表達(dá)顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例;TNMⅢ、Ⅳ期胃癌miR-101表達(dá)顯著低于Ⅰ、Ⅱ期病例,COX-2 mRNA表達(dá)顯著高于Ⅰ、Ⅱ期病例。提示miR-101、COX-2 mRNA表達(dá)與胃癌臨床進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

    圖1 30例胃癌組織與癌旁組織miR-101、COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量

    表3 miR-101、COX-2 mRNA表達(dá)與胃癌主要臨床病理特征的關(guān)系

    討 論

    在人類(lèi)腫瘤中,miRNAs表達(dá)譜改變是一個(gè)極為普遍的現(xiàn)象,miRNAs表達(dá)異常被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一[3,4]。作為最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,胃癌相關(guān)miRNAs已成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。有研究[13]發(fā)現(xiàn)血清 miR-1、miR-20a、miR-27a、miR-34、miR-423-5p表達(dá)譜異??勺鳛槲赴┰\斷和腫瘤分期進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)記。對(duì)胃癌組織標(biāo)本的檢測(cè)顯示,miR-141[14]、miR-143、miR-145[15]、miR-218[16]、miR-31[17]、let-7a miRNA[18]在癌組織中呈低表達(dá),可能與胃癌發(fā)生有關(guān);而miR-106b-25族高表達(dá)可使胃癌對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抵抗[19]。

    COX-2過(guò)表達(dá)是胃癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。以結(jié)腸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞為研究對(duì)象的體外實(shí)驗(yàn)表明miR-101可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制COX-2表達(dá),COX-2 為 miR-101 的直接靶基因[11,12]。本課題組前期研究[20]亦發(fā)現(xiàn),miR-101與COX-2在胃癌組織和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān),體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)顯示外源性miR-101可抑制胃癌細(xì)胞增殖和COX-2表達(dá),并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,證實(shí)COX-2為miR-101的直接靶基因,miR-101可在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控胃癌細(xì)胞COX-2表達(dá),作為抑癌基因參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。本研究在近期研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討miR-101與COX-2的表達(dá)變化與胃癌主要臨床病理特征的關(guān)系,及其在胃癌臨床診斷和預(yù)后判斷中的價(jià)值。

    本研究對(duì)30例胃癌組織和配對(duì)癌旁非癌組織的研究結(jié)果顯示,絕大多數(shù)胃癌組織中miR-101表達(dá)低下,伴COX-2 mRNA過(guò)表達(dá),兩者呈顯著負(fù)相關(guān)。值得注意的是,有極少數(shù)胃癌組織miR-101表達(dá)水平較高,伴隨COX-2 mRNA低表達(dá),兩者仍呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。上述發(fā)現(xiàn)證實(shí)胃癌組織中確實(shí)存在miR-101負(fù)向調(diào)控COX-2表達(dá)的機(jī)制。已知一種miRNA可與多個(gè)靶基因mRNA的3’-UTR結(jié)合,一種編碼基因mRNA亦可同時(shí)受多種miRNAs調(diào)控。關(guān)于胚胎植入的研究[21]顯示,miR-101a、miR-144、miR-199a*均可能靶向調(diào)控COX-2表達(dá)。因此除miR-101外,可能還有其他miRNAs參與調(diào)控胃癌細(xì)胞中的COX-2表達(dá)。

    本研究中絕大多數(shù)癌旁組織miR-101表達(dá)正常,COX-2 mRNA則呈低表達(dá)甚至不表達(dá),兩者亦呈顯著負(fù)相關(guān)。推測(cè)正常組織失去miR-101對(duì)COX-2的負(fù)向調(diào)控后,COX-2呈現(xiàn)病理性高表達(dá),參與組織癌變過(guò)程。miR-101與COX-2之間的負(fù)相關(guān)性有望成為胃癌臨床診斷的生物學(xué)標(biāo)記。

    本研究還觀察到胃癌組織中miR-101表達(dá)低下伴COX-2過(guò)表達(dá)與中晚期胃癌(TNMⅢ、Ⅳ期)和胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),表明兩者聯(lián)合檢測(cè)可能成為推測(cè)胃癌臨床分期和轉(zhuǎn)移潛能以及預(yù)后判斷的敏感指標(biāo)。

    綜上所述,miR-101與COX-2之間的負(fù)相關(guān)性可能有助于胃癌的臨床診斷;miR-101表達(dá)低下伴COX-2過(guò)表達(dá)與胃癌臨床進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān),對(duì)預(yù)后判斷有一定參考價(jià)值。后續(xù)研究擬增加樣本量,特別是納入更多病理類(lèi)型的胃癌標(biāo)本,從而更全面地評(píng)價(jià)miR-101表達(dá)異常與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。此外,鑒于幽門(mén)螺桿菌(Hp)是胃癌的Ⅰ類(lèi)致癌原,如能在樣本量充足的基礎(chǔ)上,在胃癌臨床病理特征中增加是否伴有Hp感染這一因素,可能有助于更好地了解miR-101與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

    1 Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

    2 Zamore PD,Haley B.Ribo-gnome:the big world of small RNAs[J].Science,2005,309(5740):1519-1524.

    3 Wiemer EA.The role of microRNAs in cancer:no small matter[J].Eur J Cancer,2007,43(10):1529-1544.

    4 Esquela-Kerscher A,Slack FJ.Oncomirs-microRNAs with a role in cancer[J].Nat Rev Cancer,2006,6(4):259-269.

    5 Su H,Yang JR,Xu T,et al.MicroRNA-101,downregulated in hepatocellular carcinoma,promotes apoptosis and suppresses tumorigenicity[J].Cancer Res,2009,69(3):1135-1142.

    6 Chandramouli A,Onyeagucha BC,Mercado-Pimentel ME,et al.MicroRNA-101(miR-101)post-transcriptionally regulates the expression of EP4 receptor in colon cancers[J].Cancer Biol Ther,2012,13(3):175-183.

    7 Wang HJ,Ruan HJ,He XJ,et al.MicroRNA-101 is down-regulated in gastric cancer and involved in cell migration and invasion[J].Eur J Cancer,2010,46(12):2295-2303.

    8 Gui T,Shen K.miRNA-101:a potential target for tumor therapy[J].Cancer Epidemiol,2012,36(6):537-540.

    9 孫為豪,孫運(yùn)良,方仁年,等.環(huán)氧化酶-2在胃癌組織中的表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系[J].中華胃腸外科雜志,2005,8(4):343-347.

    10 孫為豪,蘇菡,章禮久,等.胃泌素受體拮抗劑與環(huán)氧合酶-2抑制劑對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2006,86(4):250-254.

    11 Strillacci A,Griffoni C,Sansone P,et al.MiR-101 downregulation is involved in cyclooxygenase-2 overexpression in human colon cancer cells[J].Exp Cell Res,2009,315(8):1439-1447.

    12 Hao Y,Gu X,Zhao Y,et al.Enforced expression of miR-101 inhibits prostate cancer cell growth by modulating the COX-2 pathway in vivo[J].Cancer Prev Res(Phila),2011,4(7):1073-1083.

    13 Liu R,Zhang C,Hu Z,et al.A five-microRNA signature identified from genome-wide serum microRNA expression profiling serves as a fingerprint for gastric cancer diagnosis[J].Eur J Cancer,2011,47(5):784-791.

    14 Du Y,Xu Y,Ding L,et al.Down-regulation of miR-141 in gastric cancer and its involvement in cell growth[J].J Gastroenterol,2009,44(6):556-561.

    15 Takagi T,Iio A,Nakagawa Y,et al.Decreased expression of microRNA-143 and-145 in human gastric cancers[J].Oncology,2009,77(1):12-21.

    16 Gao C,Zhang Z,Liu W,et al.Reduced microRNA-218 expression is associated with high nuclear factor kappa B activation in gastric cancer[J].Cancer,2010,116(1):41-49.

    17 Zhang Y,Guo J,Li D,et al.Down-regulation of miR-31 expression in gastric cancertissues and its clinical significance[J].Med Oncol,2010,27(3):685-689.

    18 Zhang HH,Wang XJ,Li GX,et al.Detection of let-7a microRNA by real-time PCR in gastric carcinoma[J].World J Gastroenterol,2007,13(20):2883-2888.

    19 Petrocca F,Visone R,Onelli MR,et al.E2F1-regulated microRNAs impair TGFbeta-dependent cell-cycle arrest and apoptosis in gastric cancer[J].Cancer Cell,2008,13(3):272-286.

    20 He XP,Shao Y,Li XL,et al.Downregulation of miR-101 in gastric cancer correlates with cyclooxygenase-2 overexpression and tumor growth[J].FEBS J,2012,279(22):4201-4212.

    21 Chakrabarty A,Tranguch S,Daikoku T,et al.MicroRNA regulation of cyclooxygenase-2 during embryo implantation[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(38):15144-15149.

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