高效液相色譜法測(cè)定白色念珠菌細(xì)胞膜麥角甾醇的含量*

劉麗英，陳 虹，李雪青

(中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院，天津 300162)

近年來(lái)，真菌感染在免疫受損的病人群體中發(fā)病率迅速增加，其原因包括HIV感染、化療引起的中性粒細(xì)胞減少、器官移植引起的免疫抑制、廣譜抗生素的濫用以及激素的應(yīng)用等。深部真菌感染已成為許多疾病的主要死亡原因之一［1］，而且真菌的耐藥現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重。因此，研究抗真菌藥物的作用機(jī)制，探究真菌耐藥機(jī)理受到越來(lái)越多的醫(yī)務(wù)工作者的重視。

影響真菌麥角甾醇生物合成和功能的藥物一直是抗真菌藥物研究的重點(diǎn)。臨床應(yīng)用最成功且仍作為一線藥物而被廣泛應(yīng)用的酮康唑、氟康唑、特比萘芬等，都是以麥角甾醇為作用靶點(diǎn)，發(fā)揮其抗真菌作用［2］。本實(shí)驗(yàn)初步建立了采用高效液相色譜儀測(cè)定白色念珠菌中麥角甾醇含量的方法，以助于抗真菌藥物的研究。

1 材料與方法

1.1 藥物 PLAB(分子量432，乳白色粉末，難溶于水，純度＞95%，由武警醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室提供)，DMSO配制，高壓滅菌備用。

1.2 菌種 白色念珠菌C1a(中國(guó)醫(yī)學(xué)真菌保藏中心)。

1.3 試劑 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品［2］(Sigma公司，批號(hào)23408194);甲醇(天津市康科德科技有限公司)、石油醚(天津市科銳思精細(xì)化工有限公司)為分析純;酵母浸粉、胰蛋白胨、營(yíng)養(yǎng)肉湯(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)。

1.4 溶液及培養(yǎng)基配制 皂化劑為新鮮配制的含15%NaOH的95%乙醇溶液;YEPD培養(yǎng)基為10%酵母浸粉、20%胰蛋白胨、20%葡萄糖，溶于三蒸水中，高壓滅菌后應(yīng)用。

1.5 儀器 Millipore純水儀(Millipore公司);HZQX100A 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱;5000 μl、1000 μl加樣槍(法國(guó)GILSON);METTLER AE 260(梅特勒－托利多儀器上海有限公司);SN－CS－2D單人凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠);低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);電熱恒溫水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司);P 1000 Thermo electron Corporation高效液相色譜儀(熱電公司);N 2000色譜工作站(浙江大學(xué)智能信息工程研究所);CSF－1A超聲發(fā)生器(上海超聲波儀器廠);Phenomenex 色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);臥式矩形壓力蒸汽滅菌器(上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司)。

1.6 方法

1.6.1 色譜分析條件 色譜柱:Phenomenex(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:100% 甲醇;流速:1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:20 μl。

1.6.2 樣品的制備

1.6.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 精確稱(chēng)取麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品0.0512 g，用流動(dòng)相甲醇定容至20 ml，超聲振蕩溶解，并逐級(jí)倍比稀釋配制成 1.08、0.54、0.27、0.135、0.068和0.039 mg/ml等系列濃度作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

1.6.2.2 樣品溶液 取白色念珠菌C1a接種于沙氏斜面，30℃培養(yǎng)2 d后接種于YEPD培養(yǎng)液中，30℃150 r/min振蕩培養(yǎng)28 h，活化兩次，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期［3，4］。用 YEPD培養(yǎng)液調(diào)整真菌濃度至5×108cfu/ml。取此濃度菌液2 m1于250 m1錐形瓶中，加YEPD培養(yǎng)液98 ml，30℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)28 h。200 r/min離心10 min，PBS洗滌兩次至上清液無(wú)色，去上清液稱(chēng)各菌濕質(zhì)量。精密稱(chēng)取濕菌0.5 g，加PBS 2.5 m1和皂化劑6 m1，混勻，80℃水浴皂化60 min。加石油醚(沸程30～60℃)6 ml提取3次，將提取液合并，加水6 ml洗滌，醚層于60℃水浴揮干即得未皂化脂(NSLs)，加甲醇使溶液體積為0.5 m1/g濕菌，－20℃保存，HPLC法測(cè)定其麥角甾醇含量。

2 結(jié)果

2.1 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品峰位的確定 在已建立的色譜條件下，麥角甾醇保留時(shí)間為11.698 min，采用面積歸一化法按峰面積進(jìn)行定量。標(biāo)準(zhǔn)品中麥角甾醇的色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 線性關(guān)系 將已經(jīng)配制好的各濃度標(biāo)準(zhǔn)品，在已建立的色譜條件下進(jìn)樣20 μl，以進(jìn)樣濃度(X)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果麥角甾醇在0.068～1.08 mg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為 Y=8×106X+29 172(r=0.9989，n=3)。

2.3 精密度試驗(yàn) 以濃度為1.08 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)麥角甾醇為樣品，進(jìn)樣20 μl，測(cè)定麥角甾醇的色譜峰峰面積，每4 h測(cè)一次，得日內(nèi)精密度;以濃度為 0.54 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)麥角甾醇為樣品，隔日測(cè)一次，得日間精密度，其RSD分別為4.58%和4.81%。

圖1 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖

2.4 最低檢測(cè)限 樣品制備同標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)信噪比S/N＞3時(shí)，最低檢測(cè)濃度為0.0025 mg/ml。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 以提取的樣品溶液進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，連續(xù)進(jìn)樣3次，測(cè)得的麥角甾醇RSD為5.2%。樣品中麥角甾醇的色譜圖如圖2。

圖2 樣品中麥角甾醇HPLC色譜圖

2.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取樣品9份，每份0.1 g，分別加入濃度為1.08 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品25、50和100 μl，每個(gè)濃度配制3份樣品，混勻，作為供試品溶液，進(jìn)樣20 μl，結(jié)果見(jiàn)表1。平均回收率為79.93%，RSD 為5.44%。

2.7 樣品測(cè)定 分別精密稱(chēng)取三個(gè)批次制得濕菌0.5 g，按照樣品制備方法進(jìn)行制備，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果白色念珠菌中麥角甾醇平均含量為(0.54 ±0.0720)μg/g。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

表2 白色念珠菌中麥角甾醇含量

3 討論

真菌細(xì)胞膜為液態(tài)鑲嵌模型，在排列成雙層結(jié)構(gòu)的磷脂中夾雜有大量的麥角甾醇類(lèi)化合物，另外合成甘露聚糖、β－葡聚糖、幾丁質(zhì)等細(xì)胞壁組分所必須的酶也位于細(xì)胞膜上。麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要成分，在確保膜結(jié)構(gòu)的完整性、膜的流動(dòng)性、膜結(jié)合酶的活性、細(xì)胞活力以及物質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫嫫鹬匾饔谩｛溄晴薮既狈σ约胺瞧矫骁薮记绑w累積會(huì)導(dǎo)致真菌膜的破裂［5］。因此臨床上很多抗真菌藥物主要通過(guò)抑制麥角甾醇的生物合成來(lái)達(dá)到抑菌效果［6］，如以?xún)尚悦顾谺為代表的多烯大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗真菌藥物可直接和細(xì)胞膜上的麥角甾醇結(jié)合，形成抗生素－甾醇復(fù)合物，破壞細(xì)胞膜的滲透性，以特比萘芬(terbinafine)為代表的烯丙胺類(lèi)抗生素能抑制角鯊烯環(huán)氧化酶，引起角鯊烯在質(zhì)膜上累積，造成膜的損壞。以往國(guó)內(nèi)外學(xué)者多采用薄層掃描法、高效液相色譜法和氣相色譜法等來(lái)測(cè)定土壤、植物和藥品中麥角甾醇的含量［4，7－9］。薄層色譜雖然能夠分離，但結(jié)果不直觀，分離效果不理想，定量不準(zhǔn)確;因甾醇類(lèi)的沸點(diǎn)較高，直接用氣相色譜法分析則存在拖尾后峰型展寬等問(wèn)題;通過(guò)硅烷化、衍生化進(jìn)行測(cè)定，方法比較煩瑣。本實(shí)驗(yàn)建立了以HPLC儀來(lái)定量測(cè)定真菌中麥角甾醇含量的方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，為研究抗真菌藥物的作用機(jī)制提供了有效的手段。

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