中藥有效成分對荷視網(wǎng)膜母細胞瘤小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg表達及血清細胞因子水平的影響

陳 卓，于衛(wèi)江

(鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院，河南省腫瘤醫(yī)院藥劑科，鄭州 450008)

調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)包括天然產(chǎn)生的自然調(diào)節(jié)性T細胞和誘導產(chǎn)生的適應性調(diào)節(jié)性T細胞，Treg與自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關，其表達異常可導致自身免疫性疾病。自然調(diào)節(jié)性T細胞主要為CD4+CD25+Treg，CD4+CD25+Treg除表達CD4+分子和CD25+分子外，其特征標志為其高表達轉(zhuǎn)錄因子Foxp3。此外，F(xiàn)oxp3還是決定CD4+CD25+Treg功能的關鍵基因。CD4+CD25+Foxp3+Treg能夠抑制小鼠和大鼠的自身免疫性疾病，誘導對移植物的免疫耐受，阻礙抗腫瘤免疫應答的發(fā)生，并抑制CD4+CD25+和CD8+T細胞的活化與增殖。

視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)系一種原發(fā)于視網(wǎng)膜組織的眼內(nèi)惡性腫瘤，多見于3歲以下幼兒，約89%發(fā)生于3歲以前，單眼發(fā)病較多約占60%～82%。目前普遍認為，其發(fā)病機理是由于抗癌基因的失活才導致細胞惡變的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，導致RB發(fā)生的起始原因是視網(wǎng)膜母細胞瘤基因(Rb)的2次突變，并且Rb基因缺失的個體發(fā)生RB的幾率比其他腫瘤高2000倍。研究表明，CD4+CD25+Foxp3+Treg水平升高是腫瘤免疫抑制的重要途徑之一，且荷視網(wǎng)膜母細胞瘤移植鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg的細胞數(shù)量與正常小鼠相比明顯高出很多，利于腫瘤耐受的形成，抑制免疫系統(tǒng)對腫瘤的免疫應答，進而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本文將探討中藥有效成分對荷視網(wǎng)膜母細胞瘤小鼠脾CD+CD25+Foxp3+Treg表達及相關細胞因子水平的影響。

1 材料

1.1 動物

本實驗經(jīng)過動物倫理委員會的批準，4～6周齡清潔級雄性C57BL/6小鼠80只，體質(zhì)量15.64±3.18g，小鼠體質(zhì)量組間比較差異無統(tǒng)計學意義。由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供(許可證號SCXK-2005-0013)，中國中醫(yī)研究院廣安門醫(yī)院動物室喂養(yǎng)(許可證號SYXK(京)2005-0001)。荷視網(wǎng)膜母細胞瘤由中國醫(yī)學科學院藥物研究所提供。

1.2 藥物

黃芪、黨參購自河南省食品藥品檢驗所。

1.3 儀器

FACSCalibur分選型流式細胞儀(美國BD公司)、SM800解剖顯微鏡(日本 Canon)、SIAFRT SYNERGYHT多功能酶標儀(美國BIO-TEK)。

1.4 試劑

FITC標記抗小鼠CIM(德國Miltenyi Biotic公司)，APC標記抗小鼠CD25+、PE標記抗小鼠Foxp3(美國EBioscience公司)，流式微球陣列自由組合試劑(IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12p70，美國 BD 公司)。

2 方法

2.1 動物模型復制

取傳代后12d荷視網(wǎng)膜母細胞瘤荷瘤小鼠，剝離瘤組織，選取生長良好的腫瘤組織，制備荷視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞懸液，每只小鼠右腋皮下接種0.2mL(約含活細胞數(shù)1×106個)。

2.2 分組給藥

小鼠接種后隨機分為黃芪組、黨參組、黃芪+黨參組和對照組4大組，每大組20只。接種后24h始至處死止每日灌胃給藥1次。荷瘤對照組給予生理鹽水灌胃0.3mL/d，各組中藥浸膏用無菌水稀釋，黃芪組給予黃芪溶液(30mg/kg/d)，黨參組給予黨參溶液(20mg/kg/d)，黃芪 +黨參組給予黃芪溶液(30mg/kg/d)+黨參溶液 (20mg/kg/d)，均為灌胃給藥。

2.3 觀察指標

2.3.1 黃芪、黨參及其組方對小鼠瘤重和體質(zhì)量的影響 將每大組20只小鼠再隨機分為5d組、10d組、15d組和20d組共4小組，每小組5只。分別于接種后5、10、15、20d處死小鼠，稱荷瘤小鼠體質(zhì)量剝離腫瘤組織，精確電子天平稱取瘤重。小鼠體質(zhì)量=荷瘤小鼠體質(zhì)量－瘤重。

2.3.2 黃芪、黨參及其組方對小鼠抑瘤率的影響 于接種后5、10、15、20d處死小鼠剝離腫瘤組織，精確電子天平稱取瘤重，按下列公式計算抑瘤率。抑瘤率(%)=［1－實驗組平均瘤重(g)/對照組平均瘤重(g)］×100%。

2.3.3 黃芪、黨參及其組方對小鼠荷視網(wǎng)膜母細胞瘤轉(zhuǎn)移抑制率的影響 將各用藥組及對照組的20d組小鼠處死，剝離小鼠視網(wǎng)膜生理鹽水沖洗，Bouin氏液固定，解剖顯微鏡下觀察荷視網(wǎng)膜母細胞瘤轉(zhuǎn)移灶個數(shù)。荷視網(wǎng)膜母細胞瘤轉(zhuǎn)移抑制率(%)=［1－實驗組平均荷瘤轉(zhuǎn)移灶個數(shù)(個)/對照組平均荷瘤轉(zhuǎn)移灶個數(shù)(個)］×100%。

2.3.4 黃芪、黨參及其組方對荷瘤小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+Treg表達的影響 于接種后5、10、15、20d摘眼球取血，斷頸處死小鼠酒精消毒皮膚，迅速取脾、稱重、研磨，200目濾網(wǎng)濾過包膜及脂肪組織等，加入2mL PBS，收集脾細胞懸液計數(shù)細胞，取約1×106個細胞重懸于100μL PBS中，按照試劑說明書進行FITC-CD4、APC-CD25染色、破膜，PE-Foxp3染色上機檢測。

2.3.5 血清細胞因子水平檢測 (1)樣本采集:于接種后20 d小鼠摘眼球取血，室溫凝固4h，4000r/min離心20min，收集上清待測;(2)小鼠血清 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12p70、IFN-γ 水平用流式微球陣列技術 (CBA)檢測。①儀器調(diào)整:使用CBA FLEXSET試劑盒中的Cytometer Setup Beads設定參數(shù);②標準品制備:使用CBA FLEX-SET試劑盒中的細胞因子標準品按照梯度法稀釋為6000、3000、1500、1250、715、357、178、89、45、0ng/L10 個濃度;③制備樣品及分析:取待測血清50μL置于PE管，加入50μL捕獲微球混合物，50μL PE標記檢測抗體，室溫避光孵育4h，加入2mL洗液，150g×6min洗2次，加入200μL洗液上機檢測，BD CBA軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 11.0軟件統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標準差(珋x±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析(P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠瘤重及體質(zhì)量動態(tài)變化

20d黃芪組和黃芪+黨參組荷瘤小鼠瘤重分別為(3.38±1.53)g、(2.97 ±1.36)g，明顯低于荷瘤對照組小鼠瘤重(4.14±1.86)g(P＜0.05)，15d黃芪+黨參組荷瘤小鼠瘤重(2.73±1.27)g低于荷瘤對照組小鼠瘤重(3.68±1.83)g(P＜0.05)，其他各時間點各組瘤重無差異。各組小鼠體質(zhì)量隨天數(shù)的增加呈下降趨勢，20d黃芪組體質(zhì)量(17.06±2.53)g高于荷瘤對照組(12.95±1.74)g(P＜0.05)，20d黃芪+黨參組體質(zhì)量(17.48±2.16)g高于荷瘤對照組(12.95±1.74)g(P＜0.05)，其他各時間點各組體質(zhì)量無差異。

3.2 荷瘤小鼠抑瘤率動態(tài)變化

表1顯示，黃芪組小鼠和黃芪+黨參組小鼠腫瘤抑制率均明顯高于黨參組小鼠的腫瘤抑制率(P＜0.01)，而各時間段黃芪組小鼠腫瘤抑制率與黃芪+黨參組比較差異無統(tǒng)計學意義。各中藥有效成分組抑瘤率在用藥前期較為可觀，但隨著給藥天數(shù)的增加，各中藥有效成分組抑瘤率逐漸下降。

表1 各組腫瘤抑制率比較(%，n=5)

3.3 荷瘤小鼠荷視網(wǎng)膜母細胞瘤轉(zhuǎn)移抑制率

表2顯示，20d黃芪+黨參組荷視網(wǎng)膜母細胞瘤轉(zhuǎn)移抑制率為46.61%，視網(wǎng)膜母細胞瘤轉(zhuǎn)移灶個數(shù)顯著低于荷瘤對照組、黃芪組及黨參組(P＜0.01)。

3.4 荷瘤小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+Treg表達動態(tài)變化

圖1、表 3顯示，對照組小鼠 CD4+CD25+Foxp3+Treg表達隨荷瘤天數(shù)的增加呈上升趨勢，各中藥組小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg表達在腫瘤病程中均呈下降趨勢。20d小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg表達3個中藥組低于荷瘤對照組(P＜0.05)，15d黃芪+黨參組CD4+CD25+Foxp3+Treg表達低于荷瘤對照組(P＜0.05)。

表3 各組荷瘤小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比動態(tài)變化(%，珔x ± s，n=5)

圖1 各組荷瘤小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比變化直方圖

3.5 荷瘤小鼠血清細胞因子水平比較

表4顯示，黃芪組、黨參組和黃芪+黨參組小鼠血清IL-10水平均低于荷瘤對照組(P＜0.05);黃芪組、黨參組和黃芪+黨參組小鼠血清IL-2及IFN-γ水平均高于荷瘤對照組(P＜0.05)，而IL-6、IL-12p70水平各組與荷瘤對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。

4 討論

早在20世紀90年代初，就有報道人類腫瘤中有一類起抑制作用的T細胞，但直到20世紀90年代中期，Treg被分離出后，關于人類腫瘤中Treg是否增多的研究才逐漸增多。Woo等首次報道在非小細胞肺癌和卵巢癌的腫瘤浸潤淋巴細胞中Treg增多。這些Treg分泌TGF-β為Treg導致機體免疫低反應性首次提供依據(jù)。Curiel等證明，在卵巢癌患者中，CD4+CD25+Foxp3+Treg抑制腫瘤特異性T細胞的免疫活性，有助于腫瘤的生長、進展。又有Larmonier研究證實，荷瘤小鼠體內(nèi)Treg數(shù)目增多。Treg通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄核因子-κB的活性來影響樹突狀細胞的功能，而被抑制的樹突狀細胞表面CD80、CD86和CD40的表達水平及分泌產(chǎn)生的IL-2、TNF-α均顯著降低，使之發(fā)揮免疫負性調(diào)節(jié)作用。臨床研究也表明，腫瘤復發(fā)則患者體內(nèi)Treg數(shù)目有明顯增高，腫瘤增長與Treg細胞數(shù)目之間有明顯關系。在本研究中，黃芪和黨參的中藥組方明顯下調(diào)荷瘤小鼠IL-10的水平及CD4+CD25+Foxp3+Treg表達，可能是與化療藥物類似，通過抑制腫瘤微環(huán)境中的血管生成，促進Treg凋亡，使Treg數(shù)目減少，T細胞和NK細胞的作用恢復，從而起到有效控制腫瘤的作用。CD4+CD25+Foxp3+Treg的減少導致IL-10的分泌量減少，從而抑制CD4+CD25+Foxp3+Treg參與腫瘤免疫逃逸及對機體免疫的抑制作用。

表4 20d各組小鼠血清細胞因子水平比較(ng/L，珔x±s，n=5)

中醫(yī)認為氣虛是腫瘤的重要病理因素，黃芪屬于傳統(tǒng)益氣中藥，在體內(nèi)具有廣泛的免疫增強作用;黨參具有補中益氣之功效，含有萜類、糖和糖苷類、甾體類等多種化學成分，有提高機體免疫力、抗氧化、抗腫瘤等功能。本研究中，黃芪組和黃芪+黨參組在改善荷瘤小鼠體質(zhì)量及抑瘤率方面具有明顯功效，而在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面則以黃芪+黨參組為最佳。同時3個中藥組都能明顯下調(diào)CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比，不同中藥對荷瘤小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+Treg表達的變化趨勢有不同影響。黃芪+黨參組方較其單味藥黨參、黃芪有較好的抑瘤、抗轉(zhuǎn)移、下調(diào) CD4+CD25+Foxp3+Treg表達、下調(diào)IL-10水平的作用。綜合以上結(jié)果可以認為，中藥黃芪+黨參組方可明顯抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，并可有效改善機體的細胞免疫效應，這一結(jié)果也可為研究者探析中藥及其組方的抑癌機制及在改善西醫(yī)化療效果方面提供一些新思路和新對策。

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