糖尿病大鼠脾氣虧虛、痰瘀互阻證的尿液代謝組學(xué)分析

潘 秋，趙慧輝，陳建新，董 芳，王 偉△

(1.安徽省中醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230031;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029;3.首都師范大學(xué)分析測試中心，北京 100037)

采用高脂飼料疊加腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)復(fù)制的糖尿病大鼠模型在糖尿病研究中應(yīng)用廣泛，根據(jù)全面、動態(tài)地表征采集和檢測實驗室指標(biāo)。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，該模型具有中醫(yī)證候?qū)傩?，屬“脾氣虧虛、痰瘀互阻”證范疇［1］。臨床文獻研究結(jié)果亦證實，上述證候在臨床實際中出現(xiàn)頻率較高［2］，因此此種造模方法復(fù)制的糖尿病模型符合中醫(yī)藥研究的特征。筆者認為，從微觀角度深入闡釋此模型證候的生物學(xué)特征具有現(xiàn)實意義，一是可以將證候量化、客觀化、具體化，一是可以闡明復(fù)雜中醫(yī)藥干預(yù)手段的多靶點效應(yīng)。

表征采集和一般實驗指標(biāo)檢測尚不能全面揭示糖尿病大鼠模型的證候特征，新興的系統(tǒng)生物學(xué)與中醫(yī)學(xué)有著異曲同工之妙，因此筆者擬采用系統(tǒng)生物學(xué)之代謝組學(xué)技術(shù)從微觀角度動態(tài)地揭示大鼠模型證候的內(nèi)在特征，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)等技術(shù)建立起動態(tài)的大鼠尿液的“代謝指紋圖譜”，通過數(shù)據(jù)分析最終找出特征性的代謝產(chǎn)物群，確定“中醫(yī)證候相關(guān)代謝譜”。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雄性8周齡SD大鼠40只，體質(zhì)量220±10g，由北京維通利華實驗動物中心提供(許可證號為SCXK(京)2002-0003)，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)清潔級動物室，室溫18℃ ～25℃，相對濕度50% ～60%，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 飼料

普通飼料及高脂飼料購于中國科學(xué)院動物所。高脂飼料配方(按質(zhì)量比):20%豬油，10%蔗糖，23%酪蛋白，0.3%蛋氨酸，28%淀粉，10%糊精，7.5%纖維素，0.3%膽堿，0.1%多維預(yù)混料，0.8%多礦預(yù)混料［3］。

1.3 試劑

STZ(批號S0130)，北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司;乙腈(A996-4)，F(xiàn)isher Scientific;吡啶(110-86-1)，MREDA TECHNOLOGY INC;三氯甲烷(67-66-3)，MREDA TECHNOLOGY INC;17碳脂肪酸(H3500-5G)、TMCS(386529-100mL)、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺(394866 10×1mL)，均購自美國Sigma試劑公司。

1.4 儀器

one touch隨手測血糖儀及血糖試紙(批號200701，美國強生公司);美國 Finnigan Trace 2000/Trace DSQ氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有RTx-5毛細管柱、Xcalibur工作站、NIST譜庫;氮氣吹干機。

1.5 方法

1.5.1 造模方法 模型組高脂飲食喂養(yǎng)6周后，腹腔注射STZ 35mg/kg，對照組普通飲食喂養(yǎng)6周后，腹腔注射同等劑量 0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，注射STZ 4周后兩組大鼠尾靜脈采血檢測血糖，凡血糖值符合空腹血糖≥11.1mmol/L者納入代謝組學(xué)實驗［4］。

1.5.2 血糖、空腹胰島素、血脂測定 實驗6周末測定OGTT30min血糖、胰島素及甘油三酯、膽固醇(交由東直門醫(yī)院檢驗科測定)，出現(xiàn)血糖恢復(fù)的大鼠則予以剔除。

1.5.3 尿樣留取 成模后第3周末和第6周末分別利用代謝籠留取模型組、對照組大鼠的24h尿液，每組隨機選取8只，每只大鼠留取尿液1mL，分別保存于不同的試管中，檢測前保存于－80℃冰箱。

1.5.4 GC-MS樣本預(yù)處理 每只大鼠取600μL尿液，加入 10μL內(nèi)標(biāo)(17碳脂肪酸 6mg/mL)，加入 400μL乙腈，渦旋混合 1min，冰浴超聲10min，18000r/min，4℃離心5min。取上清液置于干凈試管中，氮氣吹干。加入50μL甲氧胺吡啶溶液(15mg/mL)混勻，30℃肟化 2h。加衍生化試劑(MST-FA∶TMCS=100∶1，v/v)50μL，混勻靜置。1h后移取上清液到微量進樣管，供GC-MS分析［5］。

1.5.5 GC-MS分析條件 氣相條件:分流比，1∶1，進樣量 0.5μL。進樣口溫度:280℃;接口溫度:250℃;升溫程序:80℃;保持2min，以每分鐘 10℃升至140℃，以每分鐘4℃升至240℃，再以每分鐘10℃升至280℃，保持3min。離子源溫度:200℃.載氣:高純度氦氣。質(zhì)譜條件:載氣流速，1.0mL/min;電離方式 EI;電子能量 70eV.掃描范圍:50 ～800m/z［5］。

1.5.6 總離子流圖分析 物質(zhì)鑒定采用質(zhì)譜自帶軟件;GC-MS總離子流圖中各峰的保留時間挑選共有峰，獲取各峰與內(nèi)標(biāo)峰的峰面積數(shù)據(jù)，用相對峰面積(與內(nèi)標(biāo)峰的比值)表示代謝物的含量。

1.5.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SAS 8.1統(tǒng)計軟件處理，計量資料正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示;同一時間點兩組間比較采用t檢驗或秩和檢驗;模式識別采用主成分分析(Principal component analysis，PCA)，應(yīng)用 SIMCA-P+ 軟件(V12.0.1，Umetrics，Sweden)。

2 結(jié)果

2.1 血糖、空腹胰島素、血脂測定(表1)

2.2 總離子流圖

第3周和第6周模型組和對照組總離子流圖分別見圖1～圖4。

表1 2組大鼠血糖、空腹胰島素、血脂比較(珋x±s)

圖1 第3周模型組總離子流圖

圖2 第3周對照組總離子流圖

圖3 第6周模型組總離子流圖

圖4 第6周對照組總離子流圖

2.3 代謝物鑒定

表2顯示，共有峰挑選后發(fā)現(xiàn)尿液中共有內(nèi)源性代謝物7種。利用NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對共有的內(nèi)源性代謝物作鑒定，按通常匹配度大于80%的鑒定結(jié)果作為可信度較大的物質(zhì)。按保留時間分別為丙氨酸、戊二酸、L-抗壞血酸、D-葡萄糖酸、棕櫚酸、十八烷酸、單甘油。

2.4 GC-MS圖譜模式識別分析

2.4.1 模型組前后比較 模型組第3周和第6周PCA得分圖和載荷圖結(jié)果表明，2組基本可以沿t1軸分開(除外第1時間點的一個樣本)，PCA前2個主成分累積得分為67.2%，疊加后續(xù)2個主成分，共計4個主成分累積得分85.7%，可覆蓋大部分代謝物信息。在前2個主成分得分圖中可見各樣品分布于得分圖的2個區(qū)域，第3周樣本分布于左方，第6周的樣本分布于右方(結(jié)果見圖5、圖6)。

表2 GC-MS尿液代謝物鑒定

圖5 模型組前后比較CA得分圖

圖6 模型組前后比較PCA載荷圖

圖9 第6周模型組、對照組PCA得分圖

圖10 第6周模型組、對照組PCA載荷圖

2.4.2 同一時間點模型組、對照組互相比較(1)第3周模型組、對照組比較 模型組、對照組PCA得分圖和載荷圖結(jié)果表明，2組基本可以沿t2軸分開，PCA前2個主成分累積得分為67.4%，疊加第3個主成分，共計3個主成分累積得分84.2%，可覆蓋大部分代謝物信息。在前2個主成分得分圖中，可見各樣品分布于得分圖的2個區(qū)域，對照組的樣本分布于上方，模型組的樣本分布于下方(結(jié)果見圖7、圖8)。

圖7 第3周模型組、對照組PCA得分圖

圖8 第3周模型組、對照組PCA載荷圖

(2)第6周模型組、對照組比較 模型組、對照組PCA得分圖和載荷圖結(jié)果表明，2組基本可以沿t1軸分開，PCA前2個主成分累積得分為53.3%，疊加后續(xù)三個主成分，共計五個主成分累積得分85.8%，可覆蓋大部分代謝物信息。在前2個主成分得分圖中可見各樣品分布于得分圖的兩個區(qū)域，對照組的樣本分布于左方，模型組的樣本分布于右方(結(jié)果見圖9、圖10)。

2.5 代謝物組內(nèi)及組間比較結(jié)果

2.5.1 組內(nèi)比較 (1)第3周:根據(jù)主成分分析結(jié)果，各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;(2)第6周:與對照組比較，模型組 L-抗壞血酸、D-葡萄糖酸、丙氨酸、戊二酸、十八烷酸含量增加(P＜0.05或 P＜0.01)。

2.5.2 組間比較 表2顯示，與第3周比較，第6周模型組L-抗壞血酸(29min)、D-葡萄糖酸、十八烷酸和戊二酸含量增加(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 大鼠尿液代謝物組內(nèi)及組間比較

表2 (續(xù))大鼠尿液代謝物組內(nèi)及組間比較

3 討論

3.1 尿液代謝物濃度的變化

從氧化應(yīng)激水平及血脂代謝異常等方面，初步解釋病證結(jié)合糖尿病大鼠模型脾氣虧虛、痰濕瘀滯證的證候相關(guān)生物學(xué)特征。

以往的實驗研究證明，大鼠模型前3周證候?qū)傩砸云馓澨撟C為主，后3周證候?qū)傩砸蕴禎耩鰷C為主［1］。尿液代謝物鑒定結(jié)果顯示，與第3周比較，第6周模型組大鼠尿液中 L-抗壞血酸、D-葡萄糖酸、十八烷酸和戊二酸含量均明顯增加。L-抗壞血酸含量增高可能是大鼠模型發(fā)生糖尿病后，體內(nèi)氧化水平激增，機體通過自身調(diào)節(jié)而出現(xiàn)的代償性抗氧化反應(yīng);十八烷酸是硬脂酸，屬于高級飽和脂肪酸，存在于部分植物性油脂和動物性油脂中，飽和脂肪酸的增加可能會引起血液中膽固醇含量上升，并促使機體對胰島素等激素產(chǎn)生抵抗，導(dǎo)致血糖升高等代謝紊亂情況出現(xiàn)。查閱KEGG檢索丙氨酸與相關(guān)疾病的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，丙氨酸異常多見于代謝異常性疾病，這將為今后實驗提供新的研究靶點。綜合上述幾種代謝物的組合規(guī)律及其含量的變化，可以初步闡釋糖尿病大鼠中醫(yī)證候的相關(guān)代謝物特征，即涉及氧化應(yīng)激和血脂代謝異常等方面。

3.2 氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)

氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)可能對部分物質(zhì)不能有效地分離和分析，今后可采用其他代謝組學(xué)技術(shù)進行補充和驗證。

氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)主要應(yīng)用在植物代謝組學(xué)研究中，分析時需對樣品進行衍生化處理來增加樣品的穩(wěn)定性和揮發(fā)性，以利于用GC-MS中的氣相色譜儀進行分離。因此，GC-MS限于分析揮發(fā)性的物質(zhì)，無法分析膜脂等熱不穩(wěn)定性的物質(zhì)和分子量較大的代謝產(chǎn)物。筆者以糖尿病病證結(jié)合大鼠的尿液為樣本，根據(jù)不同組別的不同代謝產(chǎn)物含量的變化對大鼠的證候做出了初步的闡釋。如果結(jié)合其他代謝組學(xué)技術(shù)，可能會發(fā)現(xiàn)更多有意義的代謝物，以便更深入地闡釋糖尿病病證結(jié)合大鼠證候特征的科學(xué)內(nèi)涵。由于國內(nèi)關(guān)于代謝組學(xué)的研究起步較晚，而涉及糖尿病中醫(yī)學(xué)范疇的文獻研究也比較少，可借鑒的研究結(jié)果為數(shù)不多。筆者以此模型為切入點，今后將拓展至其他造模方法復(fù)制的糖尿病大鼠模型，以逐步探索不同病證結(jié)合動物模型的代謝物特征，以期為分析中藥干預(yù)的多靶點效應(yīng)提供切實依據(jù)。

受到大鼠樣本量的限制和大鼠模型的個體差異，各組大鼠尿液代謝物在種類和含量上出現(xiàn)了一定程度的偏差。筆者認為，在今后的實驗中可以從兩方面進行改進:首先是增加實驗動物的樣本量，二是提高實驗動物的造模程度，以有利于發(fā)現(xiàn)差異明顯的代謝物群。作為最終代謝物，大鼠的尿液可能在疾病程度較輕的階段不出現(xiàn)明顯的變化，筆者認為可以結(jié)合血液檢測方法，開展血液代謝組學(xué)研究，可能會發(fā)現(xiàn)與糖、脂、蛋白代謝紊亂明顯相關(guān)的生物標(biāo)志物。同時今后的研究也可以借助系統(tǒng)生物學(xué)的其他技術(shù)方法，如蛋白組學(xué)和基因組學(xué)，深入開展2型糖尿病大鼠病證結(jié)合生物學(xué)基礎(chǔ)研究，期望通過不同組學(xué)技術(shù)交叉印證證候的相關(guān)生物學(xué)機制，并借助復(fù)雜統(tǒng)計學(xué)方法，將系統(tǒng)生物學(xué)結(jié)果和一般實驗指標(biāo)、宏觀表征融合成有機的整體，探索出一條由宏觀到微觀的有效實驗方法，探尋宏觀指標(biāo)和微觀指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)性，努力找到可以代替微觀指標(biāo)的宏觀指標(biāo)，以此有望加快證候研究的步伐。

［1］ 潘秋，趙慧輝，陳建新，等.2型糖尿病大鼠表征及其證候特征研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，4(26):683-685.

［2］ 尹德海，梁曉春，樸元林，等.2型糖尿病患者中醫(yī)證型分析及其與糖尿病慢性并發(fā)癥關(guān)系的探討［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，29(6):506-510.

［3］ M.J.Reed，K.Meszaros，L.J.Entes，et al.A new rat model of type 2 diabetes:thefat-fed，streptozotocin-treated rat［J］.Metabolism，2000，49:1390-1394.

［4］ 馮建華，姜國勝，徐云生，等.化痰活血法改善2型糖尿病模型大鼠胰島素抵抗的作用機制研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2009，24(8):1014-1020.

［5］ 簡維雄，袁肇凱，黃獻平，等.冠心病心血瘀阻證尿液代謝組學(xué)的檢測分析［J］.中醫(yī)雜志，2010，51(8):729-732.