光電結(jié)合應(yīng)激法對糖尿病大鼠心理應(yīng)激病證結(jié)合模型制作的實驗研究

葉茂茂，李慧吉，武 成，潘從清，姜 睿

(1.北京市中關(guān)村醫(yī)院，北京 100190;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193;3.天津中醫(yī)研究院，天津 300120;4.天津代謝病醫(yī)院，天津 300070;5.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150)

應(yīng)激是身體受到強烈刺激和處于緊張狀態(tài)時出現(xiàn)的一系列非特異性的全身反應(yīng)。心身醫(yī)學(xué)的研究中，應(yīng)激是一個基本因素，引起應(yīng)激的刺激叫應(yīng)激原，有多種分類，比如心理性、軀體性，而平時所指心身疾病應(yīng)激多指心理應(yīng)激。在實驗研究中，動物應(yīng)激的操作而多趨于軀體應(yīng)激，心理應(yīng)激因動物與人類心理狀態(tài)不同而涉及少、難度大。本動物模型制作為動物糖尿病狀態(tài)下心理應(yīng)激模型的制作進行探討，為糖尿病的后續(xù)實驗研究做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康雄性wistar大鼠78只，SPF級，體質(zhì)量180～200g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼以全價動物飼料，自由飲水，動物室內(nèi)自然光照，通風(fēng)良好，室溫保持在24℃，無其他不良刺激。

按體重隨機分為正常組23只，糖尿病組55只。

糖尿病模型制作過程中，糖尿病組死亡10只，篩除血糖不符合標(biāo)準(zhǔn)的15只。

隨后，進行應(yīng)激實驗時，正常組按體重、糖尿病組按血糖隨機分為以下幾組。

1.2 主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素(STZ)美國Sigma公司出品，批號S-0130;優(yōu)利特尿糖試紙;ONE TOUCHⅡ型血糖儀，血糖試紙美國雅培制藥有限公司;參照嚴氏等［1］的方法自制光電刺激實驗箱:塑料實驗盒外徑22×6×8cm，壁厚0.3cm，盒內(nèi)前部裝一個氖泡，氖泡下方安裝一個反光鏡，共20個連在一起，為自動控制的電源箱。

1.3 模型制作

1.3.1 糖尿病造模方法 參考文獻實驗性肥胖及糖尿病大鼠模型制作方法［2］制作模型，糖尿病組大鼠一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ，溶解于0.1mol/l的檸檬酸鈉緩沖液中，pH值4.0)，30mg/kg;正常組大鼠注射0.1mol/l的檸檬酸鈉緩沖液，30mg/kg，正常飲食。

2周后，糖尿病組飼料由全價動物飼料改為自制高脂飼料，配方為碳水化合物50%，脂類25%，蛋白質(zhì)17%，麩皮7%，鹽0.5%，酵母粉0.5%［3.4］。3周后追加注射1次，方法同前。再5周后測糖尿病大鼠血糖，參考文獻以血糖高于16.7mmol/l為標(biāo)準(zhǔn)，納入實驗。

1.3.2 應(yīng)激方法 實驗動物自然光照，自由飲食，實驗室隔間與飼養(yǎng)間隔音，光電刺激在每天上午8∶00～10∶00進行，實驗分兩期順序進行:Ⅰ期(第1～7天):此期間實施應(yīng)激組的大鼠每天每只分別在實驗盒內(nèi)待25min，一般大鼠都能自行鉆入籠中，不鉆者剔除。無不自行鉆入籠中大鼠;Ⅱ期(第8～22天):對應(yīng)激組大鼠實施光電刺激，對N+應(yīng)激組、STZ+應(yīng)激組給予不規(guī)則光照+不規(guī)則電擊，每天每只老鼠分別在實驗盒內(nèi)待25min。不規(guī)則電擊指電擊的頻率、時間隨機。第22天動物禁食，只給予光照不給電擊，實驗后立即做情緒喚醒行為學(xué)觀察，并取血測血糖。

給光、電刺激的參數(shù):(1)光:氖炮亮?xí)r光強度35lux，持續(xù)0.2s，滅時實驗盒內(nèi)光強度約為 2Lux。(2)電刺激參數(shù):波寬 2mS，頻率 250Hz，串長 1s，電流分別為 0.5mA、1.0mA、3.0mA、6.0Ma。

1.4 觀察內(nèi)容及方法

1.4.1 血糖檢測 用 ONE TOUCHⅡ型血糖儀和血糖試紙(美國雅培制藥有限公司)取大鼠尾靜脈血檢測各組大鼠血糖，測定時間固定于8∶00～10∶00內(nèi)進行，測試前各組動物禁食12h。

于應(yīng)激實驗第22天應(yīng)激后，立即乙醚麻醉大鼠，球后靜脈叢取血，離心分離取血清，葡萄糖氧化酶法檢測血糖。(試劑盒由?？其J生物技術(shù)中心提供，天津代謝病醫(yī)院代檢測)

1.4.2 一般狀態(tài)觀察 包括大鼠反應(yīng)性、毛色、狀態(tài)、二便及飲食、體質(zhì)量情況。

1.4.3 情緒喚醒實驗 情緒喚醒(Emotionality，指在開放條件下動物情緒始發(fā)性程度;動物對一定刺激在行為上產(chǎn)生由遺傳決定的非特異性情緒性反應(yīng))水平測定，評估動物自發(fā)的情緒興奮程度［5］。對大鼠掙扎程度、發(fā)聲程度及自發(fā)性排尿和排便情況進行記錄。

具體做法如下:抓住鼠尾，將鼠取出籠、離地，力度以大鼠不掉下為準(zhǔn)，然后觀察30s，以評定掙扎程度、發(fā)聲、排尿、排便。

(1)掙扎程度以大鼠四肢不動或輕微掙扎記0分，四肢掙扎、背部彎曲、頭朝上但未達尾部記1分，劇烈掙扎、翻身至尾部記2分;(2)發(fā)聲程度以大鼠被抓后無叫聲或1～4次嘰嘰叫，間隔時間長記0分，5～10次尖叫記1分，≥10次尖叫急促記2分;(3)自發(fā)性排尿以無排尿者記0分，有排尿者記1分;(4)自發(fā)性排便以無排便者記0分，有排便者記1分。

將5項得分相加得出大鼠情緒喚醒水平每只大鼠僅作一次行為測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，采用SPSS 11.5版本統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計方法采用多組間單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血糖情況比較

表1 大鼠第10周血糖、體質(zhì)量比較(珋x±s)

糖尿病組大鼠血糖明顯高于正常組(P＜0.01)，且高于16.7mmol/l大鼠糖尿病血糖標(biāo)準(zhǔn)，糖尿病模型成功。應(yīng)激實驗后各組血糖的檢測結(jié)果如下:STZ+應(yīng)激相對N+應(yīng)激組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，相對STZ組有差異。

2.2 大鼠一般狀態(tài)觀察(表3)

2.3 大鼠情緒喚醒實驗(表4)

表4顯示，由情緒喚醒實驗結(jié)果可見，N+應(yīng)激組相對正常組大鼠反應(yīng)性相對要低，無統(tǒng)計學(xué)意義。STZ+應(yīng)激組相對STZ組、N+應(yīng)激組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其反應(yīng)性明顯降低，說明在糖尿病狀態(tài)，應(yīng)激對大鼠反應(yīng)性的影響比正常狀態(tài)要明顯，應(yīng)激更加降低了大鼠反應(yīng)性。

表2 糖尿病模型制作結(jié)果

表3 大鼠一般狀態(tài)變化

表4 各組大鼠情緒喚醒行為測定結(jié)果(珋x±s)

3 結(jié)論及分析

從應(yīng)激實驗研究看，可以分為軀體應(yīng)激和心理應(yīng)激。研究方法包括束縛與制動、條件反射性電擊、社會剝奪(如隔離飼養(yǎng))、母性行為應(yīng)激(妊娠、哺乳、疼痛)、心理應(yīng)激(擁擠、剝奪控制權(quán))和條件性恐懼等［6］，多少還帶有軀體應(yīng)激的成分。本實驗采用光電結(jié)合應(yīng)激法，光和電的應(yīng)激時間、頻率、電的強度都是隨機的，兩者的搭配也是隨機的，并且最后1d只光照不電擊。由于前一段時間應(yīng)激為光電結(jié)合，使大鼠對光產(chǎn)生一種和電擊聯(lián)系起來的恐怖心理。從心理學(xué)實驗研究看，最后應(yīng)激是無軀體應(yīng)激(電擊)的，但只給予光照時，也可以對大鼠產(chǎn)生應(yīng)激，所以認為這種實驗應(yīng)激方法是區(qū)別于軀體應(yīng)激的心理應(yīng)激［7］。

由實驗結(jié)果看到，糖尿病應(yīng)激組相對糖尿病組的反應(yīng)性有明顯降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明應(yīng)激對糖尿病大鼠的影響比正常大鼠要大，應(yīng)激更加抑止了糖尿病大鼠的反應(yīng)性。糖尿病應(yīng)激組的血糖相對糖尿病組有升高趨勢，應(yīng)激對其也產(chǎn)生了影響。臨床觀察，糖尿病是心身疾病，其本身的發(fā)病、發(fā)展都受心理因素的影響，與實驗的結(jié)果可以相參照。進一步推測對相同的心理應(yīng)激事件，糖尿病病人相對正常人承受能力要差，而造成糖尿病病情發(fā)展［8］。

中醫(yī)的情志學(xué)說包括七情、五志、五神等內(nèi)容，它體現(xiàn)了現(xiàn)代心理學(xué)的基本心理過程。情志學(xué)說與應(yīng)激理論都認為，人體在受到外界刺激時會有相應(yīng)的反應(yīng)，而在過量、過久的應(yīng)激下會導(dǎo)致疾病發(fā)生。中醫(yī)情志學(xué)重視主觀體驗和“形神合一”，應(yīng)激理論側(cè)重心理-身體的反應(yīng)。兩者思維相似，認為“心”“身”相關(guān)?？梢?，中醫(yī)情志學(xué)與西方應(yīng)激理論從認識方法和致病因素上都有很多相通之處。中醫(yī)證候動物模型是根據(jù)中醫(yī)病因病機理論，利用特定的致病因素，在動物身上復(fù)制出與人體疾病癥狀和病理改變相近或相似的證候。本實驗根據(jù)中醫(yī)情志學(xué)病因病機理論，用無規(guī)律的不良情志刺激影響了糖尿病大鼠的病理狀態(tài)，既有血糖升高的糖尿病“病”的特征，又有精神萎靡、活動遲緩、毛發(fā)灰暗及行為學(xué)改變等類似人體的“氣機失調(diào)證”的外在表現(xiàn)，基本符合病證結(jié)合模型。

本實驗先用小劑量的STZ注射再加高脂飲食的方法制作糖尿病模型，在此基礎(chǔ)上，用光電應(yīng)激方法模擬了心理應(yīng)激，依據(jù)中醫(yī)情志學(xué)說，制作了病(糖尿病)證(氣機失調(diào)證)結(jié)合的大鼠模型，為心身疾病糖尿病的進一步后續(xù)研究打下了動物模型基礎(chǔ)，并為心理應(yīng)激實驗提供了參考。

［1］ 嚴進，王春安，葉阿莉，等.軀體性和心理性應(yīng)激對大鼠血漿皮質(zhì)酮變化的影響［J］.心理學(xué)報，1991，4:418-424.

［2］ 謝明智，劉海帆，張凌云，等.實驗性肥胖及糖尿病大鼠模型［J］.藥學(xué)學(xué)報，1985，20(11):801-8062.

［3］ 袁錦虹，劉志誠，趙玫.針刺對實驗性非胰島素依賴性糖尿病大鼠下丘腦視上核中樞的影響［J］.浙江中醫(yī)雜志，2000，11:498.

［4］ 劉永玉，毛良.實驗性NIDDM大鼠的胰島素抗性［J］.中國病理生理雜志，1991，7(4):422.

［5］ 吳大興，姚樹橋，戴曉陽，等.中國地鼠情緒喚醒水平評定量表的制定［J］.湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1999，24(5):403-406.

［6］ 錢忠明，肖德生，徐斌.c-fos表達與心理應(yīng)激腦機制的研究［J］.生理科學(xué)進展，1997，1:52-54.

［7］ 嚴進，王春安，陳宜張.心理應(yīng)激引起的大鼠行為、血漿皮質(zhì)酮及腦區(qū)氨基酸水平的變化［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1997，18(4):330-333.

［8］ 葉茂茂，李慧吉，武成，等.心理應(yīng)激對實驗性糖尿病大鼠行為、血糖的影響及復(fù)方中藥的干預(yù)作用［J］.江蘇中醫(yī)藥，2007，39(9):70-72.