水產(chǎn)品中3種氯霉素類藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定法研究

梅光明 ，陳雪昌 ，張小軍 ，劉 琴 ，李佩佩 ，何依娜 ，郭遠(yuǎn)明

（1.浙江海洋學(xué)院海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316100；2.浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316100）

氯霉素（Chloramphenicol，簡稱CAP）是一種有效的廣譜抗生素，曾廣泛應(yīng)用于食用動(dòng)物的疾病預(yù)防與防治。甲砜霉素（Thiamphenicol，簡稱TAP）和氟苯尼考(Forfenicol，簡稱FFN)為氯霉素的衍生物，抗菌譜和應(yīng)用范圍與氯霉素也基本相同。臨床試驗(yàn)表明食品中殘留的以上3種氯霉素類藥物能使人體產(chǎn)生再生性造血功能障礙以及致命的”灰嬰綜合癥”等毒副作用，其中以氯霉素毒性最強(qiáng)[1-3]。氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的化學(xué)性質(zhì)都極為穩(wěn)定，在曾經(jīng)用藥的食用性動(dòng)物組織中很容易產(chǎn)生藥物殘留。為保障食品安全，目前各國對這3種氯霉素類藥物在食品中的殘留限量都做了嚴(yán)格規(guī)定。歐盟(EEC)96/23指令中將CAP列入禁用藥，并且規(guī)定氯霉素MRPL(minimum required performance limits)值為0.30 μg/kg，甲砜霉素MRL(maximum required limits)值為50 μg/kg,氟苯尼考的MRL值為100～2 000 μg/kg。目前水產(chǎn)品中的氯霉素類藥物檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫法[4-5]、液相色譜法[6]、氣相色譜法[7-8]、氣質(zhì)聯(lián)用法[9-10]和液質(zhì)聯(lián)用法[11-13]。酶聯(lián)免疫法易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，氣相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法需化學(xué)衍生化步驟，操作過程繁瑣復(fù)雜，因而液質(zhì)聯(lián)用法成為氯霉素類藥物殘留量測定和結(jié)構(gòu)確認(rèn)的最佳方法。本試驗(yàn)采用超高效液相色譜—串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀測定水產(chǎn)品中的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)法回收率高、定量定性準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)大批量樣品的氯霉素類藥物快速準(zhǔn)確檢測。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters Acquity超高效液相色譜；Premier XE三重四級桿質(zhì)譜儀（配電噴霧ESI離子源）；SL-502N型臺(tái)式天平；AL204型電子天平；IKA T18基本型組織搗碎機(jī)；德國IKA漩渦振蕩器；Eppendorf 5810臺(tái)式高速離心機(jī)；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

甲醇、無水乙酸銨、乙酸乙酯，均為色譜純。

乙酸銨溶液（5 mmol/L）：稱取0.385 g無水乙酸銨溶解于適量水中后定容至1 000 mL。

氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取適量純度大于98%的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇溶解并定容，配成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃避光保存1年。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別準(zhǔn)確吸取1.0 mL氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋并定容至100 mL，配成1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃避光保存6個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別準(zhǔn)確吸取10.0 mL和1.0 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇稀釋并定容至100 mL，配成100 ng/mL和10 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，-18℃避光保存3個(gè)月。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確吸取100 μL的1.0 mg/mL氘代氯霉素（D5_CAP）標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇溶解并定容10 mL，配成1.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃避光保存6個(gè)月。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液：準(zhǔn)確吸取10.0 mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇稀釋并定容至100 mL，配成100 ng/mL，-18℃避光保存3個(gè)月。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：5 mmol/L 乙酸銨溶液（A）+甲醇(B)，梯度洗脫條件見表 1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programme of mobile phase

1.2.2 三重四級桿質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：3.50 kV；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：380 ℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），駐留時(shí)間：0.15 s。反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 選擇反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量Tab.2 Parent ions,daughter ions and collision energy of MRM

1.3 樣品前處理

稱取絞碎的魚糜樣品3.0 g于50 mL聚丙烯離心管內(nèi)，加入100 μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液、15 mL乙酸乙酯和0.45 mL氫氧化銨后渦旋振蕩提取2 min，再加入5.0 g經(jīng)450℃下烘干過的無水硫酸鈉，再次渦旋振蕩2 min，6 000 r/min離心5 min，上清液移入100 mL雞心瓶中。殘?jiān)性偌尤?5 mL乙酸乙酯，漩渦振蕩提取2 min，6 000 r/min離心5 min，上清液合并入雞心瓶中。45℃下旋轉(zhuǎn)濃縮至干，加入2 mL的5 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇(V/V，90+10)超聲5 min以充分溶解殘?jiān)?，加? mL正己烷渦旋混合30 s，40℃水浴中靜置5 min，6 000 r/min離心5 min分層后棄掉上清液，再加入5 mL正己烷重復(fù)操作1次，最后取1 mL樣液經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾后上機(jī)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取與凈化

氯霉素類藥物屬于弱極性物質(zhì)，易溶于有機(jī)溶劑，可用甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑提取。通過比較甲醇、乙腈和乙酸乙酯3種溶劑提取效果，結(jié)果表明采用甲醇和乙腈作為提取溶劑的添加回收率較低，3種氯霉素類藥物的添加回收率均在60%以下，而采用乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)添加回收率可達(dá)到70%以上，這與文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道的乙酸乙酯對氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的提取效率最高的結(jié)論一致。PFENNING等[16]發(fā)現(xiàn)提取液中加入少量的氨水對蝦等水產(chǎn)品具有更高的提取效率。本實(shí)驗(yàn)采用堿化乙酸乙酯提取，濃縮后用正己烷脫脂兩次，可以有效去除水產(chǎn)品中的脂肪等雜質(zhì)，上機(jī)分析結(jié)果表明MRM色譜圖基質(zhì)干擾較小，回收率較高，滿足水產(chǎn)品中氯霉素類藥物分析檢測要求。

2.2 色譜條件選擇

本研究采用UPLC快速分離氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，每個(gè)樣品在3 min以內(nèi)全部出峰，利用流動(dòng)相梯度洗脫程序可以實(shí)現(xiàn)3個(gè)目標(biāo)峰有較好的分離度。另外3種氯霉素類物質(zhì)在電噴霧負(fù)離子模式下（ESI-）的離子響應(yīng)強(qiáng)度比正離子模式下（ESI+）要高，通過在流動(dòng)相中添加乙酸銨，可以進(jìn)一步增加負(fù)離子模式下的離子響應(yīng)強(qiáng)度，并改善峰型。

2.3 質(zhì)譜條件選擇

在負(fù)離子模式下，用質(zhì)譜蠕動(dòng)泵在20 μL/min的流速下分別注入1.0 μg/mL的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氘代氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液,在母離子掃描（MS Scan）模式下，m/z在 150～750掃描范圍內(nèi)以進(jìn)行一級質(zhì)譜圖掃描,確定氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氘代氯霉素的分子離子，并比較不同錐孔電壓下的母離子強(qiáng)度，確定每個(gè)母離子有最大響應(yīng)值時(shí)的最佳錐孔電壓值。在最佳錐孔電壓下，通過子離子掃描（Daughter Scan）模式下確定每種氯霉素類藥物的碎片離子，并選擇響應(yīng)強(qiáng)度較高的2個(gè)子離子作為定量離子和定性離子，同時(shí)對碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化，確定碎片離子有最大響應(yīng)強(qiáng)度時(shí)的最佳碰撞電壓值。優(yōu)化后的參數(shù)見表2。在最佳質(zhì)譜條件和色譜條件下，3種氯霉素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC-MS/MS色譜圖如圖1所示。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的消除

由于分析物的共流出組分影響電噴霧接口的離子化效率，因而ESI離子源易受基質(zhì)效應(yīng)的影響，產(chǎn)生離子增強(qiáng)或離子抑制。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)影響大時(shí)，會(huì)降低方法的靈敏度，影響方法的準(zhǔn)確性。為最大限度消除基質(zhì)效應(yīng)干擾，本試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配法進(jìn)行定量分析。以空白魚糜樣品的提取液為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液，可使標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液具有相同的離子化環(huán)境，再結(jié)合采用氘代氯霉素作為內(nèi)標(biāo)物定量，從而較好地消除基質(zhì)效應(yīng)?？瞻撞蒴~樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液后測定圖譜如圖2所示。

圖1 2.00 ng/mL的CAP、TAP和FFN混合標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of CAP,TAP and FFN mxied standard solution(2.00 ng/mL)

2.5 線性范圍與檢出限

取適量3種混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，用空白魚糜樣品提取液（提取時(shí)不加入內(nèi)標(biāo)物）稀釋配置成濃度分別為0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0 和 50.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液，使內(nèi)標(biāo)物濃度均為5.00 ng/mL，進(jìn)樣后以目標(biāo)組分與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值Y對相應(yīng)的質(zhì)量濃度X(ng/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過添加標(biāo)準(zhǔn)品配制一定濃度的魚肉樣品，經(jīng)前處理和檢測后，以S/N=10時(shí)為分析方法的定量檢出限。3種氯霉素類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量檢出限見表3。

2.6 準(zhǔn)確度和精密度

以空白草魚和對蝦為測試對象，考察樣品3個(gè)梯度濃度加標(biāo)下測定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，表4結(jié)果表明氯霉素在加標(biāo)量0.10～2.00 μg/kg范圍內(nèi)，平均回收率為84.7%～104.9%；甲砜霉素在加標(biāo)量0.50～10.0 μg/kg范圍內(nèi)，平均回收率為88.2%～104.1%；氟苯尼考在加標(biāo)量0.50～10.0 μg/kg范圍內(nèi)，平均回收率為91.9%～104.1%；且測定結(jié)果的批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度和精密度完全可以滿足水產(chǎn)品中氯霉素類藥物殘留檢測的要求。

圖2 草魚空白2.00 μg/kg CAP、TAP和FFN加標(biāo)樣品測定MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of blank grass crap meat spiked with 2.00 μg/kg CAP,TAP and FFN

表3 3種氯霉素類藥物的測定線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和定量檢出限Tab.3 Regression equations,linear range,correlation coefficients,and Quantitation limits of 3 chloramphenicol drugs

2.7 實(shí)際樣品測定

結(jié)合本單位承擔(dān)的農(nóng)業(yè)部2012年流通環(huán)節(jié)鮑魚質(zhì)量安全普查任務(wù)工作要求，課題組從北京、杭州和福州等城市的農(nóng)貿(mào)市場、批發(fā)市場和超市采集了各品種鮑魚樣品共50份，對氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的殘留量進(jìn)行檢測分析，結(jié)果中2個(gè)樣品檢出含有氟苯尼考，檢測值分別為14.3 μg/kg和2.01 μg/kg。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中3種氯霉素類藥物殘留量，結(jié)合基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量法和同位素內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)，較好地消除了基質(zhì)效應(yīng)，方法前處理過程簡便快捷，檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高、精密度好，在大批量實(shí)際樣品的檢測中取得了滿意的結(jié)果。

表4 空白樣品中添加CAP、TAP和FFN的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Tab.4 Recoveries and relative standard deviations of CAP,TAP and FFN in spiked samples(n=6)

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