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    青霉素菌絲體中麥角固醇分離和純化研究

    2013-10-19 07:16:40劉玲吳正奇王雄萬端極
    關(guān)鍵詞:粗品皂化有機(jī)溶劑

    劉玲,吳正奇,王雄,萬端極

    (1.湖北工業(yè)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 武漢430068;2.湖北工業(yè)大學(xué)膜技術(shù)研究所,湖北 武漢430068)

    0 引言

    麥角固醇又稱麥角甾醇,是脂溶性維生素D2的前體,當(dāng)受到紫外線照射時,分子中4個碳環(huán)中的一個發(fā)生斷裂,變成維生素D2;此外還可作為可的松、黃體酮、蕓苔素內(nèi)酯等物質(zhì)的生產(chǎn)原料[1].

    目前國內(nèi)外麥角固醇的生產(chǎn)方式有2種,一種是用微生物發(fā)酵法,所用菌種有酵母菌、曲霉和青霉等[2-4],但發(fā)酵成本高,不利于大工業(yè)化生產(chǎn).另一種是用醇堿法從菌絲體中皂化提取,即用一定濃度的堿與醇混合液來提取,提取后的上清液再用乙醚萃取得麥角固醇[5-6],此法在反應(yīng)和萃取階段使用了大量的有機(jī)溶劑,溶劑回收費(fèi)用高,生產(chǎn)安全性差.

    目前常用的麥角固醇提取純化方法是用石油醚、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑反復(fù)萃取提純[7].有機(jī)溶劑用量大,溶劑回收費(fèi)用高昂、成本居高不下.

    本文中采用堿溶液來皂化麥角固醇,將菌絲體中的結(jié)合態(tài)麥角固醇變?yōu)橛坞x態(tài),再酶解,將堿提后渣中的醇溶性蛋白水解為多肽溶于水相,用乙醇萃取可得到純度較高的麥角固醇產(chǎn)品.本工藝避免了提取和純化過程中有機(jī)溶劑的大量使用,大大減少麥角固醇的生產(chǎn)成本,為麥角固醇的生產(chǎn)開創(chuàng)了一條新生產(chǎn)工藝,同時也為麥角固醇的提純提供了新方法.

    1 實驗部分

    1.1 材料 青霉素濕菌絲(華北制藥有限公司發(fā)酵自制);麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品為Singma公司產(chǎn)品.

    木瓜蛋白酶,南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司;堿性蛋白酶,無錫杰能科生物工程有限公司;風(fēng)味蛋白酶,Novo酶制劑公司;復(fù)合蛋白酶,Novo酶制劑公司.

    1.2 主要實驗儀器 PHS-3C型數(shù)顯酸度計:杭州奧立龍儀器有限公司;HX1201Z型電子天平:慈溪市天冬衡器廠;H H-4數(shù)顯恒溫水浴鍋:金壇市城西曉陽電子儀器廠;JJ-1型精密增力電動攪拌器:江蘇曉陽電子儀器廠;TDL-5-A型低速大容量離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;戴安Ulti Mate3000液相色譜儀:石家莊博萊特儀器有限公司.

    1.3 實驗方法 設(shè)定實驗工藝如下:

    青霉素濕菌絲體→濾干→堿提→渣→醇提→旋蒸→粗品→加水酶解→過濾→醇提→旋蒸→高純度麥角固醇.

    實驗操作:將濾干后的菌絲體,按照物料比1∶15,加入15%的NaOH溶液中,在85℃的水浴鍋中提取2 h.堿提后的溶液離心,將渣加入一定量的乙醇溶液常溫下提取30 min.醇提液旋蒸可得到麥角固醇粗品.粗品加水加酶進(jìn)行酶解,過濾,再用乙醇萃取濾紙上的不溶物,提取液旋蒸結(jié)晶可得到高濃度的麥角固醇.

    1.3.1 堿提 根據(jù)工藝選擇物料皂化劑比(A),皂化溫度(B),用堿濃度(C),皂化時間(D)這4個因素作為考察對象,每個因素各取3個水平,以麥角固醇的皂化收率為指標(biāo),通過正交試驗,得出最佳皂化條件(表1).

    表1 因素水平表

    1.3.2 最佳用酶選擇 青霉素菌絲體中各成分含量如下:蛋白42%~43%,麥角固醇0.8%~1.2%,脂肪1.7%~2.0%,無機(jī)鹽4%,灰分6%~7%,其余為纖維素.在堿提過程中大部分蛋白、脂類物質(zhì)、無機(jī)鹽都被除去,渣中主要為纖維素、麥角固醇、灰分和一些不溶于水的蛋白.由于菌絲體中的纖維素不溶于水,所以渣經(jīng)一次醇提后的溶液中主要是麥角固醇和蛋白.本工藝中酶解的目的是將粗品中的醇溶性蛋白水解為多肽溶于水相,使之與不溶于水的麥角固醇分離達(dá)到純化的目的.

    本實驗選用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶在其各自最佳水解條件下對麥角固醇粗品進(jìn)行水解,加酶量為3%,以工藝最后得到的產(chǎn)品中麥角固醇的純度為指標(biāo)確定最佳用酶種類(表2).

    1.3.3 酶解正交試驗 酶解過程中,溫度、時間、酶用量是影響酶解效果的主要因素.因此,將溫度、時間、酶用量3個因素進(jìn)行正交實驗,因素水平如表3所示.

    表2 各種酶的最佳水解條件

    表3 酶解正交因素水平表

    1.4 分析方法

    1.4.1 麥角固醇含量測定和分析方法 采用高效液相色譜法對麥角固醇進(jìn)行測定:高效液相色譜條件為色譜柱 HC-C18(4.6 mm×150.0 mm,5μm),流動相為純甲醇,流速1.5 m L/min,檢測波長281 nm,柱溫30℃,進(jìn)樣量10μL.采用外標(biāo)法按峰面積進(jìn)行定量[8-9].另外選取一定量的麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品,用乙醇溶解配制一系列濃度的麥角固醇,在已建立的色譜條件下檢測,然后對萃取后的樣品進(jìn)行HPLC分析,計算峰面積并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較,得出所測麥角固醇的含量.

    麥角固醇得率計算公式:麥角固醇/%=[(C×V×N)/W]×100.式中,C為麥角固醇的質(zhì)量濃度(g/m L),V為溶液體積(m L),N為稀釋倍數(shù),W為菌體干質(zhì)量(g).

    1.4.2 菌絲體中麥角固醇最大含量的確定 利用最后結(jié)論3中得出的最佳堿提條件對原料進(jìn)行最大化提取,得出菌絲體中麥角固醇最大含量為1.2%.

    1.4.3 麥角固醇純度計算方法 麥角固醇純度/%=醇提液的體積×醇提液中麥角固醇的濃度/醇提液結(jié)晶后的固體質(zhì)量×100.

    2 結(jié)果和討論

    2.1 堿提正交試驗結(jié)果 從正交實驗可以看出各因素影響麥角固醇提取率的主次順序為B>C>D>A.最優(yōu)條件參數(shù)組合為A3B2C3D2,即在物料比1∶15,溫度85℃,NaOH濃度為15%,提取時間2 h的條件下,提取率最高(表4).該條件表中沒有,因此需做驗證實驗,經(jīng)驗證在該條件下提取率為99%.并且通過液相檢測結(jié)果,計算得粗品中麥角固醇的純度為34%.

    表4 正交試驗結(jié)果

    2.2 水解用酶的選擇 由圖1可知,堿性蛋白酶的水解效果最好,經(jīng)該酶水解后制得產(chǎn)品中麥角固醇的純度可達(dá)到67%.因此本實驗選取堿性蛋白酶為水解用酶.

    圖1 各酶在其最佳條件下的水解效果圖

    2.3 酶解正交實驗 由表5的R值看出,各因素對實驗結(jié)果影響的主次順序為:E>G>F.最優(yōu)條件參數(shù)組合為:E2F2G2,即在溫度為45℃,酶解時間2 h,加酶量為2.0%的條件下,為最優(yōu)工藝條件.該條件表中沒有,因此需做驗證實驗,經(jīng)驗證在該條件下,麥角固醇純度為70%,產(chǎn)品的得率為95%.所以最優(yōu)工藝條件為:溫度45℃,酶解時間2 h,加酶量為2.0%.

    表5 正交試驗結(jié)果

    3 結(jié)論

    本研究以濕菌體直接加堿皂化及酶法純化除雜的方法,取代傳統(tǒng)工藝中直接加入有機(jī)溶劑回流提取以及多種有機(jī)溶劑反復(fù)萃取提純的方法,大大降低了有機(jī)溶劑用量.以麥角固醇的提取率為指標(biāo),通過正交篩選出最佳皂化條件為:物料皂化劑比1∶15,NaOH溶液濃度為15%,溫度85℃,皂化時間2 h.以麥角固醇酶解后純度為指標(biāo),選擇堿性蛋白酶在溫度45℃,時間2 h,加酶量2.0%,p H=8的條件下酶解.最終產(chǎn)品中麥角固醇的純度可達(dá)到70%,提取率可達(dá)到95%.

    [1]李蓮英,張志敏.維生素 D攝入不足對兒童健康的影響[J].中國兒童保健雜志,1997,5(2):122.

    [2]Wang Tianqi,Li Hanxiang,Wang Manyi,et al.Integrative extraction of ergosterol-(1-3)-α-D-glucan and chitosan fromPenicilliumchrysogenumMycelia[J].Chin Chem Eng,2007,15(5):725-729.

    [3]譚艾娟,寧瑋霽,劉愛英,等.紅曲霉產(chǎn)麥角固醇液體發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品科技,2008,29(9):434-436.

    [4]江宏文,張毅,李娜,等.酵母菌株產(chǎn)麥角固醇發(fā)酵條件優(yōu)化[J].現(xiàn)代食品科技,2009,25(7):801-802.

    [5]韓慶雪,聞建平,馮國龍.麥角固醇工業(yè)化提取工藝研究[J].河北化工,2007,30(2):42-45.

    [6]南春輝.麥角固醇研究進(jìn)展[J].中國新技術(shù)新產(chǎn)品,2009(10):9-10.

    [7]邱從平,張慧波,施立欽,等.麥角固醇提取及分離純化研究[J].醫(yī)藥衛(wèi)生論壇,2005(12):138-139.

    [8]孫佰申,周立平,陳旭峰,等.HPLC法測定紅曲霉發(fā)酵樣品中麥角固醇的含量[J].中國食品添加劑,2004(2):89-92.

    [9]李敏,董慧.雙水相萃取—高效液相色譜法測定酵母細(xì)胞中麥角固醇含量[J].分析試驗室,2009,28(11):119-120.

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