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    鴨坦布蘇病毒感染導(dǎo)致種鵝產(chǎn)蛋性能下降及死亡的病因分析

    2013-10-19 06:25:22黃建
    浙江畜牧獸醫(yī) 2013年5期
    關(guān)鍵詞:鵝場鴨坦布蘇

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    (余姚市禽畜病防治研究所,浙江余姚 315400)

    自2012年7月以來,浙江和江蘇境內(nèi)部分種鵝場的種鵝發(fā)生一種以產(chǎn)蛋率下降,并有少量死亡的疾病,使部分種鵝場遭受了巨大經(jīng)濟(jì)損失。病鵝主要表現(xiàn)為食欲減退,排黃綠色糞便,部分病鵝出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,頭頸扭曲,發(fā)病10 d后,產(chǎn)蛋率下降70%~80%,采用多種抗生素治療,無明顯效果。

    為探明近期引起浙江和江蘇部分地區(qū)種鵝產(chǎn)蛋性能下降并引起死亡的病因,為制定鵝病防治措施提供依據(jù)。筆者對浙江和江蘇境內(nèi)三家發(fā)病典型的種鵝場進(jìn)行系統(tǒng)病原研究,現(xiàn)報告如下。

    1 材料與方法

    1.1細(xì)菌分離 病料采自浙江和江蘇境內(nèi)三家種鵝場的病死鵝。無菌采集肝臟劃線接種于麥康凱和血平板上,37℃培養(yǎng)24 h。另外,用肝臟直接涂片,進(jìn)行瑞氏染色和革蘭氏染色。

    1.2RT-PCR檢測 采集病死鵝肝臟、脾臟及出血、壞死的卵泡膜,常規(guī)法勻漿,反復(fù)凍融3次,用RNAsimple Total RNA Kit提取RNA,用AMV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,具體操作按說明書進(jìn)行。按照國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的禽流感RT-PCR檢測方法進(jìn)行禽流感檢測[1];按照Liu(2007)[2]建立的新城疫病毒檢測方法進(jìn)行新城疫病毒檢測;鴨坦布蘇病毒檢測采用本實(shí)驗(yàn)室建立的鴨坦布蘇病毒RT-PCR檢測方法檢測:RT-PCR方法擴(kuò)增的目的片段為420 bp,PCR反應(yīng)體系為25 μL:2×Taq PCR Master Mix(購自TIANGEN)12.5 μL,上下游引物各0.5 μL(20 pmol/μL),模板2 μL,用水補(bǔ)充體積至25 μL;反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min,按94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 30 s進(jìn)行35個循環(huán),然后72℃延伸7 min結(jié)束反應(yīng),取5 μL PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

    1.3病毒分離 無菌采集3家種鵝場(分別標(biāo)記為場1、場2、場3)的病死鵝脾臟,出血、壞死卵泡膜,按常規(guī)方法勻漿,反復(fù)凍融3次后,離心15 min(8000 rmp/min),取上清液用直徑為0.22 μm的一次性無菌濾器過濾后,各接種9日齡SPF雞胚5枚,去除24 h內(nèi)死胚,觀察雞胚死亡情況。收集24 h后死胚及5 d內(nèi)未死活胚尿囊液,按常規(guī)方法進(jìn)行血凝試驗(yàn)[3],并按照1.2方法進(jìn)行鴨坦布蘇病毒檢測。

    2 試驗(yàn)結(jié)果

    2.1病變觀察 主要病變?yōu)槠⑴K腫大,有大量白色壞死點(diǎn);卵泡膜充血、出血,卵泡液化、壞死,有的卵泡破裂(詳見圖1);部分病鵝肝臟腫大,其他臟器無明顯病變。

    2.2細(xì)菌分離 病死鵝肝臟直接涂片染色鏡檢,在1000倍油鏡下未觀察到細(xì)菌,劃線接種的麥康凱平板和血平板于37℃培養(yǎng)24 h后均無細(xì)菌生長。

    2.3RT-PCR檢測 病料組織RNA,分別進(jìn)行禽流感、新城疫和鴨坦布蘇病毒檢測,結(jié)果3份病料只有采用鴨坦布蘇病毒檢測引物PCR擴(kuò)增獲得特異性片段,且大小與目的片段一致(詳見圖2)。

    圖1 剖檢病變

    M:1500 bp DNA Marker;1:陽性對照;2,3,4:檢測樣品;5:陰性對照

    2.4病毒分離 病料接種SPF雞胚后4 h,場1、場2均有4枚雞胚死亡,死胚尿囊液中有大量尿酸鹽,肝臟、腎臟出血腫大。收集死胚和活胚尿囊液常規(guī)血凝試驗(yàn)。結(jié)果所有尿囊液均不能凝聚1%雞紅細(xì)胞。對尿囊液進(jìn)行鴨坦布蘇病毒RT-PCR檢測,只有死胚尿囊液能擴(kuò)增出特異性目的片段,表明分離到的兩株病毒為鵝源鴨坦布蘇病毒。

    通過對3家種鵝場送檢的病死鵝進(jìn)行剖檢病變觀察,病料細(xì)菌分離、RT-PCR檢測及病毒分離,結(jié)果表明鴨坦布蘇病毒感染是導(dǎo)致種鵝產(chǎn)蛋率下降的主要病因。

    3 小結(jié)與討論

    鴨坦布蘇病毒是2010年4月出現(xiàn)的一種新病毒,陸新浩等(2012)[4]首次報道浙江地區(qū)的蛋鴨發(fā)生一種以產(chǎn)蛋率大幅下降為主要特征的新疫病,但未對該病原進(jìn)行鑒定。隨后曹貞貞等[5-8]通過病毒分離、RT-PCR擴(kuò)增和基因序列分析等系統(tǒng)研究證實(shí)該病的病原為鴨坦布蘇病毒,屬黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬(Flavivirus)的一種新病毒,病毒粒子呈球形,直徑為30~50 nm的有囊膜單股正鏈RNA病毒。目前對鴨坦布蘇病毒病的確診主要依靠病毒分離和分子生物學(xué)檢測[9]。

    目前,鵝感染鴨坦布蘇病毒的資料報道較少,據(jù)黃欣梅(2011)[10]報道,2010年4月至11月在江蘇地區(qū)的鵝群曾發(fā)生鴨坦布蘇病毒感染,造成種鵝產(chǎn)蛋率大幅下降、肉鵝大批死亡,部分病鵝出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,主要病變?yōu)槁殉病⒛X膜、肝臟等多器官出血,脾臟腫大壞死。臨床癥狀和剖檢病變與本研究病例癥狀基本一致。另外,為了確診引起近期浙江及江蘇部分地區(qū)種鵝產(chǎn)蛋率下降病因,筆者曾對病死鵝進(jìn)行了RT-PCR檢測和病毒分離,證實(shí)該病的病原是鴨坦布蘇病毒。有關(guān)鴨坦布蘇病毒的流行規(guī)律、病原特性、防治措施等有待進(jìn)一步研究探討。

    [1] 國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)“禽流感病毒RT-PCR試驗(yàn)方法”[S].NYT 772-2004.

    [2] Liu H, WangZ, Wu Y, etal. Molecular epidemiological analysis of Newcastle disease virus isolated in China in 2005 [J]. J Virol Methods,2007,140:206-211.

    [3] 殷震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997:262-264,351-354,632.

    [4] 陸新浩,陳秋英,劉鴻,等. 當(dāng)前產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋驟然下降的病因初探[J].中國家禽,2010,32(23):49-50.

    [5] 曹貞貞,張存,黃瑜,等.鴨出血性卵巢炎的初步研究[J].中國獸醫(yī)雜志,2010,46(12):3-6.

    [6] 萬春和,施少華, 程龍飛, 等. 一種引起種(蛋)鴨產(chǎn)蛋驟降新病毒的分離與初步鑒定[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報,2010,25(6):663-666.

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    [9] 朱麗萍,顏世敢.鴨坦布蘇病毒研究進(jìn)展[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2012,20(1):79-82.

    [10] 黃欣梅,李銀,趙冬敏等.新型鵝黃病毒JS804毒株的分離與鑒定[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2011,27(2):354-360.

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