Beclinl基因沉默對胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞生長的影響

李曉姝 郭曉鐘 王華 肖鳳君 李宏宇 任麗楠

·短篇論著·

Beclinl基因沉默對胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞生長的影響

李曉姝 郭曉鐘 王華 肖鳳君 李宏宇 任麗楠

Beclin1基因與酵母自噬基因Atg 6同源，是參與哺乳動物自噬體形成，調(diào)控細(xì)胞自噬過程的重要基因。Beclin1自噬基因的缺陷可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避自噬性死亡[1]，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Beclin1后可促進(jìn)細(xì)胞的自噬活性，并降低了其成瘤能力[2]。本研究觀察沉默胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞的Beclin1基因表達(dá)后對其增殖、凋亡及細(xì)胞周期分布的影響，為胰腺癌的基因治療提供新的思路。

一、材料與方法

1．靶向Beclin1的siRNA表達(dá)載體構(gòu)建：根據(jù)siRNA設(shè)計原理，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建3個插入靶向Beclin1基因的siRNA(Beclin1-siRNA)質(zhì)粒以及陰性對照siRNA(NC-siRNA)質(zhì)粒和熒光標(biāo)記的siRNA(FAM-siRNA)質(zhì)粒。經(jīng)篩選后選擇沉默效果最好的Beclin1-siRNA序列插入表達(dá)載體U6/Neo，構(gòu)建表達(dá)載體U6/Neo-shBeclin1，同時構(gòu)建陰性對照載體pGPU6/Neo-shNC及熒光對照載體pGPU6/GFP/Neo-shNC。

2．細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選：人胰腺癌細(xì)胞系MiaPaCa-2由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板，采用Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen 公司)將上述3種表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染MiaPaCa-2細(xì)胞，按說明書操作。轉(zhuǎn)染后6、24 h在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。取轉(zhuǎn)染效率高的細(xì)胞的1/10進(jìn)行傳代，48 h后在培養(yǎng)液中加入G418(400 μg/ml)篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。18 d后收集細(xì)胞。

3．Beclin1蛋白表達(dá)檢測：取對數(shù)生長期細(xì)胞，提取蛋白，采用常規(guī)蛋白質(zhì)印跡法檢測Beclin1蛋白，以β-actin為內(nèi)參。兔抗人Beclin1單抗為Reagents 公司產(chǎn)品，兔抗人β-actin抗體及羊抗兔IgG多抗為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

4．細(xì)胞增殖活性檢測：采用CCK法檢測。試劑盒為日本Dojindo Laboratories產(chǎn)品，按照試劑盒說明書操作。最后在酶聯(lián)免疫檢測儀于450 nm處測定細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48、72、96 h的吸光值(A450值)，以對照組為1，繪制增殖曲線。實驗重復(fù)3次。

5．細(xì)胞凋亡及周期分析：取培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，離心棄上清，應(yīng)用1 ml預(yù)冷PBS洗滌3次，采用PI染色法檢測細(xì)胞凋亡，采用ANNEXIN V-FITC N+PI法檢測細(xì)胞周期。檢測試劑盒購自北京眾康志恒生物公司，按照試劑盒說明書操作，最后上流式細(xì)胞儀檢測。

二、 結(jié)果

1．轉(zhuǎn)染細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)的變化：轉(zhuǎn)染NC-siRNA的MiaPaCa-2細(xì)胞的Beclin1蛋白表達(dá)量為0.7046，轉(zhuǎn)染3條靶向Beclin1-siRNA的MiaPaCa-2細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)量分別為0.4077、0.2831、0.1073(圖1)，Beclin1蛋白的表達(dá)均下調(diào)，其中Beclin1-siRNA-3具有最佳的抑制效果，該靶序列為GCTGCCGTTATACTGTTCT。故應(yīng)用該序列進(jìn)行后續(xù)實驗。

1：NC-siRNA；2：Beclin1-siRNA1；3：Beclin1-siRNA2；4：Beclin1-siRNA3

2．Beclin1-siRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)MiaPaCa-2細(xì)胞增殖、凋亡及周期的變化：穩(wěn)轉(zhuǎn)的MiaPaCa-2細(xì)胞與陰性對照組相比較，其細(xì)胞增殖、凋亡無明顯變化(圖2、3)，但對MiaPaCa-2細(xì)胞的周期分布產(chǎn)生明顯影響(圖4)， S期細(xì)胞比例從對照組的(10.93±0.19)%減少到(9.20±0.22) %，G2期細(xì)胞比例從對照組的(7.92±2.56) %減少到(7.00±2.82)%，而G1期細(xì)胞從對照組(81.15±2.75)%增加到(83.80±2.60)%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為7.308、6.129、30.6，P值均<0.01)。

討論RNA干擾(RNA interference，RNAi) 是近些年發(fā)展起來的一種新技術(shù)，它主要是通過21～25 nt的小RNA反義鏈的介導(dǎo)，識別并靶向切割同源mRNA，從而發(fā)生轉(zhuǎn)錄后沉默。目前人工合成的siRNA已成為研究基因沉默后功能改變的一種重要工具，被廣泛應(yīng)用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的研究中。本研究采用該技術(shù)成功地獲得Beclin1低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)MiaPaCa-2細(xì)胞株。

圖2 轉(zhuǎn)染Beclin1-siRNA及NC-siRNA的MiaPaCa-2細(xì)胞的增殖曲線

圖3 轉(zhuǎn)染Beclin1-siRNA及NC-siRNA的MiaPaCa-2細(xì)胞的凋亡

圖4 轉(zhuǎn)染Beclin1-siRNA及NC-siRNA的MiaPaCa-2細(xì)胞的周期分布

自噬是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象。通過自噬，細(xì)胞內(nèi)受損變性或衰老的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器被消化降解，同時也可以再利用被分解的氨基酸、核苷酸、游離脂肪酸等以滿足機體代謝需要或某些細(xì)胞器的更新，因此對于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著非常重要的作用。目前在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)有近30種自噬相關(guān)基因，它們通過多種信號通路調(diào)控細(xì)胞自噬的水平。其中Beclin1基因是一種重要的自噬調(diào)控基因，它所編碼的Beclin1蛋白能夠引導(dǎo)其他自噬相關(guān)蛋白定位于自噬體膜上，在自噬體的形成過程中起到關(guān)鍵的作用。

目前研究提示Beclin1可能參與細(xì)胞凋亡，但其作用機

制非常復(fù)雜，自噬啟動或是抑制凋亡仍無一致結(jié)論。有研究結(jié)果顯示，Beclin1可以通過BH3結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子Bcl-2相互作用[3-4]，這可能是Beclin1參與細(xì)胞凋亡的機制之一。推測磷酸化及非磷酸化的Bcl-2與Beclin1結(jié)合，可能對自噬或凋亡產(chǎn)生相反的作用，這與細(xì)胞的不同狀態(tài)有關(guān)[5]。另一方面，有研究顯示，人乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌等腫瘤細(xì)胞中存在高頻率的Beclin1單等位基因缺失[1]。人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Beclin1后其自噬活性增強，同時降低其成瘤能力，提示自噬活性與抑制細(xì)胞增殖有關(guān)[2]。

本研究結(jié)果顯示，沉默Belin1基因表達(dá)后，細(xì)胞的凋亡及增殖均未受到影響，是否存在其他重要的信號通路調(diào)控自噬過程需要進(jìn)一步通過對自噬小體數(shù)量變化等檢測去驗證。

本研究結(jié)果還顯示，Beclin1表達(dá)沉默后，MiaPaCa-2細(xì)胞的周期發(fā)生改變，S期細(xì)胞明顯減少，G1期細(xì)胞明顯增多，提示Beclin1低表達(dá)促使胰腺癌MiaPaCa-2從S期進(jìn)入G1期，推測Beclin1在促進(jìn)腫瘤形成過程中可能起作用。有研究認(rèn)為，在腫瘤的不同發(fā)展階段，自噬對細(xì)胞的影響不同。在腫瘤發(fā)生早期，抑制自噬可以引起癌前細(xì)胞持續(xù)生長，此時自噬抑制腫瘤形成[6-7]。當(dāng)腫瘤處于進(jìn)展階段時，惡變的細(xì)胞持續(xù)分裂增殖，并利用自噬機制對抗?fàn)I養(yǎng)缺乏和缺氧，尤其在實體腫瘤內(nèi)部血供不良的癌細(xì)胞中表現(xiàn)更明顯，此時自噬發(fā)揮的是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的作用[8]。本研究與有些研究結(jié)論[1-2]不一致，其原因也可能與Beclin1異常表達(dá)在不同腫瘤組織及腫瘤發(fā)生、發(fā)展的不同階段產(chǎn)生的自噬作用不同有關(guān)。

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2013-03-20)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.019

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郭曉鐘，Email: guoxiaozhong1962@163.com