ARHI基因轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)基因表達(dá)譜的影響

楊紅 路新卿 李驥 朱永健 丁輝 王健 胡益群 鄧衛(wèi)萍 錢家鳴

·論著·

ARHI基因轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)基因表達(dá)譜的影響

楊紅 路新卿 李驥 朱永健 丁輝 王健 胡益群 鄧衛(wèi)萍 錢家鳴

目的觀察ARHI基因轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)譜的影響。方法采用脂質(zhì)體法將表達(dá)ARHI基因的質(zhì)粒pIRES2-EGFP-ARHI、空質(zhì)粒pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染胰腺癌PANC1細(xì)胞。采用基因芯片RT2ProfilerTMPCR Array行實(shí)時(shí)定量PCR，分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因表達(dá)譜，包括84個(gè)與凋亡和自噬相關(guān)基因。結(jié)果ARHI基因轉(zhuǎn)染組PANC1細(xì)胞有9個(gè)基因mRNA表達(dá)下調(diào)，38個(gè)基因mRNA表達(dá)上調(diào)，37個(gè)基因mRNA表達(dá)變化無意義。在與凋亡相關(guān)的基因中有8個(gè)促凋亡基因表達(dá)顯著上調(diào)(>6倍)，主要為TNFR/TRFSR家族基因(TNFSF8、TNFRSF10B、TNFRSF11B、TNFRSF9)、CIDE家族基因(DFFA)、CASP家族基因(CASP10、CASP8)和死亡結(jié)構(gòu)域家族基因(DAPK1)，其中以DAPK1上調(diào)尤為明顯，達(dá)42.83倍；抗凋亡基因中3個(gè)基因(CD27、BCL2L10、BIRC4)表達(dá)顯著上調(diào)(>6倍)，3個(gè)基因(BCL2、BAD、BAG4)表達(dá)輕度上調(diào)(>2倍)，1個(gè)基因(BCL2L1)表達(dá)輕度下調(diào)(<-2倍)。在與自噬相關(guān)的基因中3個(gè)促自噬基因(TNFRSF10B、DAPK1、CASP10)表達(dá)顯著上調(diào)(>6倍)，4個(gè)基因(TNFRSF10A、FADD、TP53、TP53BP2)表達(dá)輕度上調(diào)(>2倍)；3個(gè)抑制自噬基因(BCL2、CASP8、FAS)表達(dá)輕度上調(diào)(>2倍)，1個(gè)基因(MCL1)表達(dá)輕度下調(diào)(<-2倍)。結(jié)論ARHI基因顯著上調(diào)細(xì)胞凋亡及自噬重要調(diào)控基因Caspase-8 和DAPK1。

胰腺腫瘤； 細(xì)胞凋亡； 自噬； 基因表達(dá)； ARHI gene

胰腺癌的癌變過程是癌基因突變和抑癌基因失活的累積過程。由于胰腺位于后腹膜，活檢取組織不易，故其分子生物學(xué)研究還存在很多空白。ARHI基因是胰腺癌抑癌基因。本研究組以往的研究結(jié)果顯示[1-2]，ARHI蛋白在正常胰腺組織中廣泛表達(dá)，但在胰腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，ARHI基因可以誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬，而細(xì)胞凋亡和自噬與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究應(yīng)用基因芯片高通量檢測84個(gè)與凋亡和自噬相關(guān)基因，探討ARHI基因促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)自噬的相關(guān)分子通路。

材料與方法

一、胰腺癌細(xì)胞株及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1來源于ATCC(American type culture collection)。常規(guī)培養(yǎng)并傳代。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)分為實(shí)驗(yàn)組、空質(zhì)粒組、脂質(zhì)體組和親本PANC1細(xì)胞對(duì)照組(對(duì)照組)，每組3個(gè)復(fù)孔，采用脂質(zhì)體法(Lipofectamine 2000, Invitrogen公司)分別轉(zhuǎn)染表達(dá)ARHI基因的質(zhì)粒pIRES2-EGFP-ARHI、空質(zhì)粒pIRES2-EGFP、單加脂質(zhì)體和常規(guī)培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后2 d，培養(yǎng)液中加入終濃度為900 μg/ml的G418 (Gibco公司)篩選14 d，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PANC1細(xì)胞株，具體步驟見文獻(xiàn)[2]。

二、實(shí)時(shí)定量PCR芯片檢測

收集各組細(xì)胞，采用Trizol(Gibro 公司)提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Promerga試劑盒逆轉(zhuǎn)成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR芯片(RT2ProfilerTMPCR Array)購自美國SABioscience公司，包含84個(gè)基因，有TNF/TNFR家族、BCL2/BAG家族、BIR家族、CARD家族、死亡家族、TRAF家族和caspase及相關(guān)家族等。PCR反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min，循環(huán)40次。通過PCR儀自帶軟件獲取Ct值。所有檢測均設(shè)3個(gè)平行管，三平行管的Ct值差距<0.5為有效數(shù)據(jù)，取其平均Ct值。以β-actin為內(nèi)參照。依據(jù)2-△△Ct公式，以空質(zhì)粒組為基準(zhǔn)計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。>2倍為輕度上調(diào)，>6倍為顯著上調(diào)；<-2倍為輕度下調(diào)，<-6倍為顯著下調(diào)。

結(jié) 果

一、凋亡及自噬相關(guān)基因表達(dá)譜的變化

與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較，實(shí)驗(yàn)組PANC1細(xì)胞有9個(gè)基因mRNA表達(dá)下調(diào)，38個(gè)基因mRNA表達(dá)上調(diào)，37個(gè)基因mRNA表達(dá)變化無意義。上調(diào)基因較明顯的是TNFSF/TFNRSF家族成員、死亡結(jié)構(gòu)域和死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域家族成員、CIDE家族成員。TRAF家族表達(dá)改變不顯著。在凋亡的決定基因家族中，Caspase家族中凋亡啟動(dòng)基因Caspase 8、Caspase 10明顯上調(diào)，而BCL-2家族基因表達(dá)改變不顯著。此外p53和DNA損傷反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)改變亦不顯著(表1)。

二、ARHI基因?qū)ANC1細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

基因芯片中有58個(gè)促凋亡基因和26個(gè)抗凋亡基因，其中8個(gè)促凋亡基因表達(dá)顯著上調(diào)(>6倍)，主要為TNFR/TRFSR家族基因(TNFSF8、TNFRSF10B、TNFRSF11B、TNFRSF9)、CIDE家族基因(DFFA)、CASP家族基因(CASP10、CASP8)和死亡結(jié)構(gòu)域家族基因(DAPK1)，其中以DAPK1上調(diào)尤為明顯，達(dá)42.83倍；3個(gè)抗凋亡基因(CD27、BCL2L10、BIRC4)顯著上調(diào)(>6倍，圖1)，3個(gè)基因(BCL2、BAD、BAG4)表達(dá)輕度上調(diào)(>2倍)，1個(gè)基因(BCL2L1)表達(dá)輕度下調(diào)(<-2倍)。

圖1 ARHI基因轉(zhuǎn)染后PANC1細(xì)胞與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)

基因表達(dá)倍數(shù)基因表達(dá)倍數(shù)基因表達(dá)倍數(shù)TNFLigand家族CD40LG(TNFSF5)4.66FASLG(TNFSF6)1.87LTA2.62TNF1.65TNFSF102.03CD701.69TNFSF819.74TNF受體家族CD40(TNFRSF5)1.11FAS(TNFRSF6)2.62LTBR1.04TNFRSF10A2.61TNFRSF10B9.27TNFRSF11B6.71TNFRSF1A1.82TNFRSF1BTNFRSF211.39TNFRSF25-1.10CD276.86TNFRSF96.98BCL-1家族BAD2.58BAG11.39BAG31.06BAG42.39BAK1-1.76BAX-1.74BCL22.73BCL2A1-2.61BCL2L1-2.34BCL2L107.42BCL2L11-1.24BCL2L21.14BCLAF14.25BID1.51BIK3.43BNIP12.58BNIP21.82BNIP32.12BNIP3L1.01HRK4.18MCL1-2.06Caspase家族CASP1-1.96CASP1010.15CASP142.34CASP2-1.19CASP3-1.43CASP4-1.16CASP5-3.43CASP6-2.13CASP7-1.45CASP85.91CASP9-1.02IAP家族NAIP1.75BIRC22.93BIRC31.98BIRC418.34BIRC61.16BIRC85.13TRAF家族TRAF2-2.47TRAF3-1.18TRAF4-1.78CARD家族APAF12.34BCL101.73BIRC22.93BIRC31.98NOD11.13CARD63.72CARD83.04CASP1-1.96CASP2-1.19CASP41.16CASP5-3.43CASP9-1.02CRADD1.81NOL31.78PYCARD2.41RIPK21.20死亡區(qū)域家族CRADD1.81DAPK142.83FADD2.11FAS2.62TNFRSF10A2.61TNFRSF10B9.27TNFRSF11B6.71TNFRSF1A1.82TNFRSF211.39TNFRSF25-1.10TRADD-1.75死亡效應(yīng)區(qū)域家族CASP85.91CASP1010.15CFLAR3.98FADD2.11CIDE區(qū)域家族CIDEA4.32CIDEB4.08DFFA6.13P53和DNA損傷反應(yīng)ABL1-1.69AKT1-1.89APAF12.34BAD2.58BAX-1.74BCL22.73BCL2L1-2.34BID-1.51CASP3-1.43CASP6-2.31CASP7-1.45CASP9-1.02GADD45A2.62TP534.12TP53BP24.55TP739.62其他BFAR5.61NAIP1.75BRAF1.30CFLAR3.98DFFA6.13IGF1R1.37LTBR1.04TNF1.65CD276.86

三、ARHI基因?qū)ANC1細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響

3個(gè)促自噬基因(TNFRSF10B、DAPK1、CASP10)表達(dá)顯著上調(diào)(>6倍)，4個(gè)基因(TNFRSF10A、FADD、TP53、TP53BP2)表達(dá)輕度上調(diào)(>2倍)，2個(gè)Caspase基因(CASP3、CASP9)表達(dá)略下調(diào)；3個(gè)抑制自噬基因(BCL2、CASP8、FAS)表達(dá)輕度上調(diào)(>2倍)，1個(gè)基因(MCL1)表達(dá)輕度下調(diào)(<-2倍)，AKT1、TNF基因表達(dá)改變不明顯(圖2)。

圖2 ARHI基因轉(zhuǎn)染后PANC1細(xì)胞與自噬相關(guān)基因的表達(dá)

討 論

上世紀(jì)90年代研究者就提出細(xì)胞增殖和凋亡之間的失衡造成了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。近幾年又提出了自噬的概念[3-4]。自噬為凋亡所需，通常先于凋亡進(jìn)而啟動(dòng)凋亡。自噬可保護(hù)細(xì)胞免于發(fā)生凋亡和壞死，也可以向凋亡轉(zhuǎn)化，共同促進(jìn)細(xì)胞死亡。自噬和細(xì)胞凋亡之間存在錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，可以通過不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用，也可能它們的上游存在相同的信號(hào)通路，但在不同的因素影響下調(diào)控著兩個(gè)程序不同的方向。

文獻(xiàn)報(bào)道[5-7]細(xì)胞凋亡分為外源性途徑和內(nèi)源性途徑。內(nèi)源性途徑稱為線粒體途徑，其主要通過p53、BCL-2家族協(xié)助啟動(dòng)凋亡信號(hào)。外源性途徑稱為死亡受體途徑，通過死亡功能結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白TRADD和FADD的結(jié)合，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示ARHI基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后顯著上調(diào)TNFR/TNFSR家族基因、死亡結(jié)構(gòu)域家族基因和CASP家族基因，對(duì)p53和DNA損傷反應(yīng)基因及BCL-2家族基因的表達(dá)無顯著影響，提示ARHI基因通過上調(diào)TNFR受體促進(jìn)死亡結(jié)構(gòu)域基因的上調(diào)(DAPK1)，進(jìn)而激活Caspase-8啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，即為外源性途徑。

DAPK1基因是與細(xì)胞骨架相關(guān)的鈣/鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是p53依賴的細(xì)胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因，也是細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制劑。該基因可以激活Caspase8而活化Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促動(dòng)細(xì)胞凋亡的途徑，也可以磷酸化beclin1，減少beclin1和bcl-XL結(jié)合，從而誘導(dǎo)自噬反應(yīng)。因此該基因是凋亡和自噬的關(guān)聯(lián)基因，Caspase-8也是細(xì)胞凋亡的重要啟動(dòng)基因。近年來研究顯示，Caspase-8在細(xì)胞自噬中非常重要[8-9]。Yu等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-8不僅可以調(diào)節(jié)凋亡，還可以抑制自噬性細(xì)胞死亡。Caspase-8抑制劑可通過調(diào)節(jié)Beclin 1和Atg7來促進(jìn)自噬，提示caspase-8在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬中可能起到開關(guān)的作用。本研究還分析了ARHI基因?qū)ψ允上嚓P(guān)的17個(gè)基因表達(dá)譜的影響，結(jié)果顯示ARHI基因可以顯著上調(diào)TNFRSF10B等7個(gè)基因的表達(dá)，其中DAPK1表達(dá)上調(diào)42.83倍，caspase-8基因表達(dá)上調(diào)5.91倍，提示ARHI促進(jìn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬主要是通過caspase-8和DAPK1來調(diào)控兩個(gè)程序的執(zhí)行。

[1] Yang H,Lu X,Qian J,et al.Imprinted tumor suppressor gene ARHI induces apoptosis correlated with changes in DNA methylation in pancreatic cancer cells. Mol Med Rep,2010,3:581-587.

[2] Lu X, Qian J, Yu Y, et al.Expression of the tumor suppressor ARHI inhibits the growth of pancreatic cancer cells by inducing G1 cell cycle arrest. Oncol Rep,2009,22: 635-640.

[3] Fan YJ, Zong WX. The cellular decision between apoptosis and autophagy. Chin J Cancer,2013,32:121-129.

[4] Eisenberg-Lerner A, Bialik S, Simon H-U, et al, Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death Differ,2009, 16: 966-975.

[5] 周彩虹， 黃啟福.凋亡與腫瘤及其治療進(jìn)展.中國病理生理雜志，2004,20:2124-2133.

[6] Rudin CM, Thompson CB. Apoptosis and disease:regulation and clinical relevance of programmed cell death. Annu Rev Med, 1997, 48:267-281.

[7] 焦俊霞,高維娟.細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究進(jìn)展.中國老年學(xué)雜志，2010,30:853-856.

[8] Hou W,Han J, Lu C, et al. Autophagic degradation of active caspase-8,A crosstalk mechanism between autophagy and apoptosis. Autophagy,2010, 6: 891-900.

[9] Yu L, Alva A, Su H,et al. Regulation of an ATG7-beclin1 program of autophagic cell death by caspase-8. Science, 2004, 304: 1500-1502.

EffectofARHItransfectiononapoptosisandautophagyrelatedgeneexpressionprofileofPANC1cells

YANGHong,LUXin-qing,LIJi,ZHUYong-jian,DINGHui,WANGJian,HUYi-qun,DENGWei-ping,QIANJia-ming.

DepartmentofGastroenterology,PekingUnionHospital,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100730,China

ObjectiveTo investigate the effect of ARHI transfection on the apoptosis and autophagy related gene expression profile of PANC1 cells.MethodsPlasmids pIRES2-EGFP-ARHI which expressing ARHI and empty plasmid pIRES2-EGFP were transfected into PANC1 cells. Expression profile, including 84 apoptosis and autophagy related genes was detected by using quantitative real-time PCR based RT2Profiler TM PCR Array.ResultsIn PANC1 cells transfected with pIRES2-EGFP-ARHI, the expression of mRNA of 9 genes were down-regulated, and 38 were up-regulated, while 37 were not significantly changed. Among the apoptosis related genes, 8 pro-apoptotic genes were significantly up-regulated (>6 folds), and them mainly consisted TNFR/TRFSR family (TNFSF8, TNFRSF10B, TNFRSF11B, TNFRSF9), CIDE family (DFFA), CASP family (CASP10, CASP8), death domain gene family (DAPK1), and the increase of DAPK1 was the most significant (42.83 folds). Three anti-apoptotic genes (CD27, BCL2L10, BIRC4) were significantly up-regulated (>6 folds), and 3 genes (BCL2, BAD, BAG) were slightly up-regulated (>2 folds), 1 gene (BCL2L1) was slightly down-regulated (>2 folds). Among the autophagy related genes, 3 pro-autophagy genes were significantly up-regulated (>6 folds), 4 genes (TNFRSF10A, FADD, TP53, TP53BP2) were slightly up-regulated (>2 folds); 3 anti-autophagy genes (BCL2, CASP8, FAS) were slightly up-regulated (>2 folds), 1 gene (MCL1) was slightly down-regulated (>2 folds).ConclusionsARHI significantly up-regulates autophagy-related important regulatory genes Caspse8 and DAPK1.

Pancreatic neoplasms; Apoptosis; Autophagy; Gene expression; ARHI gene

2013-07-30)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.002

國家自然科學(xué)基金(81072055)；高等學(xué)校博士點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20101106120059)

100730 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院消化科

錢家鳴，Email：qjiaming1957@aliyun.com