乳酸菌對(duì)仔犬犬瘟熱和犬細(xì)小病毒抗體效價(jià)的影響試驗(yàn)

(公安部沈陽(yáng)警犬技術(shù)學(xué)校，遼寧沈陽(yáng) 110034)

犬瘟熱(CDV)和犬細(xì)小病毒病(CPV)是危害犬類較為嚴(yán)重的兩種傳染病，發(fā)病率和死亡率較高。目前，這兩種疾病的防控方法仍以疫苗免疫為主，結(jié)合抗菌素治療的綜合防控措施，但因部分疫苗的保護(hù)力不強(qiáng)、免疫保護(hù)期較短等原因，致使預(yù)防效果不甚理想。

近年來(lái)，研究資料表明，乳酸菌能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，維持腸道生態(tài)菌群平衡，抵御外來(lái)病原菌的入侵，激活免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。乳酸菌作為犬體內(nèi)的正常菌群，能使腸道pH值降低，抑止致病菌在腸道內(nèi)的生長(zhǎng)和繁殖，同時(shí)還可產(chǎn)生天然抗菌物質(zhì)，對(duì)腸道致病菌具有明顯的抑制和殺滅等作用[1]。

CDV和CPV危害,尤以對(duì)斷乳仔犬最為嚴(yán)重，本試驗(yàn)旨在通過(guò)斷乳仔犬飼喂乳酸菌后檢測(cè)CDV和CPV抗體水平，觀察抗體水平變化，以期揭示乳酸菌與犬體之間的相互關(guān)系，為獸醫(yī)臨床上尋求防控仔犬CDV和CPV及提高機(jī)體免疫應(yīng)答和生長(zhǎng)性能提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物 選擇8只健康狀況良好的德國(guó)牧羊母犬所產(chǎn)的30只仔犬，隨機(jī)分為3組，每組10只，即試驗(yàn)1組，試驗(yàn)2組及對(duì)照組。

1.2試驗(yàn)藥品 乳酸菌素片Lactobacillus acidophilus 133株，(黑龍江某藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，生產(chǎn)批號(hào)為0711301，每片含乳酸菌素0.4 g，乳酸菌1×108efu/g。

1.3基礎(chǔ)日糧 基礎(chǔ)日糧選用由某食品(中國(guó))有限公司出品的“某訓(xùn)養(yǎng)場(chǎng)特供幼犬糧”。配料為精選肉類(牛肉、雞肉)及肉類副產(chǎn)品，精煉植物油及動(dòng)物性油脂，全脂奶粉，加碘食鹽，維生素(A、B、D、E)和礦物質(zhì)(銅、鐵、鋅、硒等)，山梨酸鉀，抗氧化劑。營(yíng)養(yǎng)成分分析保證值：粗蛋白質(zhì)≥28.0%、總脂肪≥14.0%、粗纖維≤5.0%、鈣≥1.10%、礦物質(zhì)≥1.5%、總磷≥0.9%、鹽≤1.8%、灰分≤10.0%、水分≤10.0%。

1.4試驗(yàn)方法 仔犬出生后隨母犬吮哺母乳，20日齡補(bǔ)喂奶粉，30日齡斷奶，試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組飼喂基礎(chǔ)日糧+乳酸菌片，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，詳見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)仔犬分組情況

1.5抗體水平檢測(cè) 犬瘟熱/細(xì)小病毒抗體檢測(cè)試劑盒(法國(guó)辛百克斯生產(chǎn))。試劑盒成分：2×8孔包被CDV抗原的酶標(biāo)板和2×8孔包被CPV抗原的酶標(biāo)板；A瓶—陽(yáng)性質(zhì)控，1.0 mL；B瓶—陰性質(zhì)控(樣品稀釋液)，3.0 mL；C瓶—酶標(biāo)記物，2.0 mL；D瓶—發(fā)色底物，3.0 mL；E瓶—10×洗滌濃縮液，100 mL。根據(jù)ELISA原理，檢測(cè)仔犬血清或血漿中CDV/CPV抗體水平。

1.6飼養(yǎng)管理 分欄飼養(yǎng)，按常規(guī)管理，免疫程序?yàn)椋?-6周齡：接種小犬二聯(lián)苗(PuPPy DP)；8-9周齡：接種犬六聯(lián)苗(DHPPi+L)；12周齡：接種犬六聯(lián)苗(DHPPi+L、或七聯(lián)苗(DHPPi+RL)。

1.7數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)結(jié)束后，資料匯總，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，分析各組仔幼犬血清中CPV與CDV抗體效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化。

1.8CDV、CPV抗體檢測(cè)判斷標(biāo)準(zhǔn) CDV抗體檢測(cè)陽(yáng)性質(zhì)控滴度為1∶16，CPV抗體檢測(cè)陽(yáng)性質(zhì)控滴度為1∶80，顏色深于陽(yáng)性質(zhì)控樣品抗體效價(jià)CDV>1∶16，CPV>1∶80。顏色淺于陽(yáng)性質(zhì)控樣品抗體效價(jià)CDV<1∶16，CPV<1∶80。試驗(yàn)結(jié)果有效：陽(yáng)性質(zhì)控顯示藍(lán)色，陰性質(zhì)控顯示無(wú)色。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1CDV抗體效價(jià)動(dòng)態(tài)變化 詳見(jiàn)表2。

表2 各組仔犬CDV、CPV抗體效價(jià)在不同時(shí)期的比較

由表2可知，CDV抗體效價(jià)變化20～35日齡，對(duì)照組均處陰性(CDV<1∶16)，但自首次免疫后，抗體效價(jià)均≥1∶16，說(shuō)明免疫應(yīng)答效果良好；試驗(yàn)組則從20～90日齡抗體水平均為陽(yáng)性(CDV≥1∶16)，說(shuō)明免疫應(yīng)答效果良好。

從CPV、CDV抗體效價(jià)變化可知20日齡時(shí)，各組抗體效價(jià)較高，但到35日齡時(shí)，抗體效價(jià)有所降低，但在免疫后均表現(xiàn)出良好的免疫應(yīng)答現(xiàn)象。

在整個(gè)試驗(yàn)中，試驗(yàn)組的抗體效價(jià)均明顯高于對(duì)照組。CPV抗體效價(jià)，試驗(yàn)1組明顯優(yōu)于試驗(yàn)2組，尤以35～50日齡時(shí)段較為明顯；而CDV的抗體效價(jià)，試驗(yàn)1組與試驗(yàn)2組差異不顯著。

2.2CPV抗體效價(jià)動(dòng)態(tài)變化 詳見(jiàn)表2。

由表2可知，20日齡前各組CPV≥80，差異不明顯；免疫接種后試驗(yàn)組CPV抗體效價(jià)明顯高于對(duì)照組，且試驗(yàn)1組高于試驗(yàn)2組，對(duì)照組CPV抗體則呈陰性(CPV<1∶80)；50日齡時(shí)，各組抗體效價(jià)均有所下降。但試驗(yàn)組仍高于對(duì)照組；至75日齡后，試驗(yàn)組與對(duì)照組均高于1∶80，但從酶標(biāo)板的顏色差異上看，試驗(yàn)組仍高于對(duì)照組。

3 分析與討論

據(jù)本次試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)分析CDV、CPV血清抗體效價(jià)，表明乳酸菌可提高CDV、CPV抗體水平。以高劑量試驗(yàn)組效果最佳。因此，可初步認(rèn)為口服高劑量的乳酸菌可明顯提高CDV、CPV抗體效價(jià)。

3.1CDV與CPV抗體效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律 仔犬體內(nèi)的CDV抗體，90%通過(guò)初乳獲得，5%通過(guò)胎盤(pán)獲得?？梢?jiàn)乳汁傳遞是母源抗體傳遞的主要途徑，抗體主要通過(guò)乳汁傳遞給仔犬。仔犬從初乳中獲得高水平的母源抗體可阻止CPV傳播及感染犬排毒。母源抗體在幼犬體中平均9.7 d左右可下降一半以上，最長(zhǎng)可持續(xù)2個(gè)月左右，初乳對(duì)幼犬的保護(hù)力優(yōu)于人工主動(dòng)免疫及輸入高免血清產(chǎn)生的被動(dòng)免疫[2]。多數(shù)仔犬在6～8周齡(最長(zhǎng)14周齡)時(shí)，母源抗體迅速減少或消失,CDV血清抗體滴度1∶100以下是免疫的臨界滴度，降至1∶16以下時(shí)，則有可能感染CDV；故一般幼犬3周齡內(nèi)很少感染CPV,3周齡后、幼犬母源抗體<1∶80，對(duì)CPV易感，1∶80是抵抗CPV的保護(hù)效價(jià)。所以，如能測(cè)定仔犬或母犬CDV和CPV抗體效價(jià)，就能確定仔犬進(jìn)行免疫接種的確切時(shí)間。

3.2血清中CDV、CPV抗體水平含量與幼犬抵抗力的相關(guān)性 Banks等研究表明(1989)[3，4],免疫球蛋白的濃度與傳染病的易感性成負(fù)相關(guān)，如果轉(zhuǎn)移的是特異性抗體，對(duì)相應(yīng)傳染病的抵抗力增強(qiáng)，這種抵抗力可通過(guò)已建立的診斷來(lái)檢測(cè)抗體含量。據(jù)Gorbam報(bào)道(1960)[5]，多數(shù)仔犬的母源抗體在8～12周齡開(kāi)始減弱，15周齡消失。當(dāng)血清中母源抗體下降到1∶20以下時(shí)較為易感。有資料曾報(bào)道(2004)[6]犬瘟熱抗體的半衰期為8.4 d，母源抗體可通過(guò)初乳轉(zhuǎn)移給仔犬，幼犬母源抗體中和滴度大于1∶20時(shí)，幼犬能免受CDV的攻擊。一般幼犬在3周齡以內(nèi)很少感染CPV,3周齡后、幼犬的母源抗體HI< 26.3(80×)，僅在26.3(80×)～24.3(20×)間，CPV最易感，而26.3(80×)是抵抗CPV的保護(hù)效價(jià)。因此，可根據(jù)測(cè)定轉(zhuǎn)移的抗體消長(zhǎng)情況，來(lái)推測(cè)抗體的效價(jià)變化，研究當(dāng)抗體從峰值下降到一定水平時(shí)，既有抗病能力又可進(jìn)行主動(dòng)免疫，可以使幼犬從出生到接種疫苗的時(shí)期內(nèi)都能得到足夠的保護(hù)[7]。

3.3乳酸菌對(duì)抗體水平的影響 從犬傳染病的預(yù)防角度，疫苗在進(jìn)入犬體后會(huì)發(fā)生兩種免疫應(yīng)答,一種是抗體介導(dǎo)的,即B淋巴細(xì)胞反應(yīng)；一種是由細(xì)胞介導(dǎo)的,即T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。

除了疫苗會(huì)引起免疫應(yīng)答，乳酸菌也可促進(jìn)免疫器官的發(fā)育,從而有更多的淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體。微生態(tài)制劑中有許多細(xì)菌的細(xì)胞壁成分，如細(xì)胞壁的肽聚糖和脂多糖等對(duì)動(dòng)物免疫系統(tǒng)，具有不同的免疫調(diào)節(jié)作用，其在體內(nèi)是一種較強(qiáng)的B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活劑，使B細(xì)胞分泌抗體的能力增強(qiáng)，微生態(tài)制劑中的有效成分作為抗原不斷刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，使機(jī)體的免疫功能始終處在較高的活性狀態(tài)，機(jī)體的B細(xì)胞分泌特異性抗體的功能也得到不斷的刺激，從而使B細(xì)胞抗體分泌能力也得到延長(zhǎng)，抗體滴度下降較慢[8]。

本試驗(yàn)中試驗(yàn)組乳酸菌在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)均能提高CPV與CDV效價(jià)，且高劑量組(3.2 g)顯著優(yōu)于低劑量組(2 g)，說(shuō)明高劑量組和低劑量組均能提高CDV、CPV抗體水平，但高劑量組提升程度較低劑量組大。

CPV、CDV抗體的高低是反映犬免疫狀態(tài)的指標(biāo)，也是反映犬特異性體液免疫性能的指標(biāo)。本試驗(yàn)中表明隨注射疫苗時(shí)間的延長(zhǎng)能延緩抗體水平的降低，且乳酸菌與疫苗可協(xié)同促進(jìn)機(jī)體循環(huán)抗體的產(chǎn)生。

ELISA檢測(cè)添加乳酸菌試驗(yàn)組和對(duì)照組的抗體結(jié)果顯示，試驗(yàn)組要比對(duì)照組提前出現(xiàn)免疫應(yīng)答，而且其抗體水平隨著時(shí)間的推移比對(duì)照組明顯提高，結(jié)果說(shuō)明乳酸菌這種益生菌對(duì)體液免疫也有影響和促進(jìn)作用。

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