血必凈注射液對(duì)急性百草枯中毒大鼠IL-1、IL-6、TNF-α的影響

張志剛，任 靜，賈 東，趙 敏

在我國(guó)，百草枯中毒已成為內(nèi)科常見(jiàn)的急危重癥，病死率極高，可達(dá)60.3%～87.8%［1-3］。百草枯可對(duì)人體多臟器造成損傷，患者最終多死于多臟器功能衰竭或呼吸衰竭，而其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚［4］。目前認(rèn)為可能與百草枯中毒引起的炎性反應(yīng)有關(guān)，因此，如何抑制百草枯引起的炎性反應(yīng)、減少肺纖維化及多臟器功能損傷成為目前研究的焦點(diǎn)。

大量基礎(chǔ)研究以及臨床實(shí)踐證明，血必凈具有強(qiáng)效抗內(nèi)毒素、拮抗內(nèi)毒素誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子失控性釋放的作用，同時(shí)提高超氧化物歧化酶活性等作用［5-8］。

本研究通過(guò)檢測(cè) IL-1、IL-6、TNF-α 的表達(dá)水平，探討血必凈對(duì)百草枯引起的炎性反應(yīng)的抑制作用，從而為臨床治療提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g，由我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。飼養(yǎng)室溫度20～25℃，恒溫，濕度65%恒濕，飼養(yǎng)動(dòng)物均單籠飼養(yǎng)，自由飲水。血必凈注射液由天津紅日藥業(yè)有限公司惠贈(zèng);20%百草枯購(gòu)于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院;免疫組織化學(xué)所需試劑:ELISA試劑盒，酶聯(lián)免疫吸附法PBS緩沖液，均購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司;蒸餾水、生理鹽水等均由我院實(shí)驗(yàn)室提供。主要儀器:ELISA酶標(biāo)檢測(cè)儀，微量移液器，塑料滴頭;37℃孵育箱，-80℃深低溫冰箱，高速離心機(jī)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及中毒模型制造 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠按照隨機(jī)原則分組編號(hào)，分為Ⅰ組(空白對(duì)照組)、Ⅱ組(百草枯染毒組)、Ⅲ組(血必凈治療組)，每組10只。Ⅰ組大鼠給予生理鹽水10 mL/kg灌胃;Ⅱ、Ⅲ組大鼠給予百草枯20 mg/kg灌胃(將20%百草枯稀釋至0.2%百草枯，給予10 mL/kg=20 mg/kg灌胃)，觀察大鼠的生命狀態(tài)，注意大鼠有無(wú)死亡。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的治療及標(biāo)本采集、分析 在上述動(dòng)物處置30 min后，Ⅰ、Ⅱ組大鼠分別給予生理鹽水10 mL/kg腹腔注射，1次/d，直至大鼠被處死;血必凈治療組大鼠分別給予血必凈注射液10 mL/kg腹腔注射，1次/d，直至大鼠被處死。上述大鼠在處理后3、7、14d分別取眶內(nèi)眥靜脈血，于4℃高速離心機(jī)3 000 r/min高速離心15 min后，取上層血清，置于-80℃冰箱待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用單因素獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

大鼠在14d內(nèi)死亡1只，為染毒組大鼠，其余大鼠均存活;Ⅱ組及Ⅲ組大鼠較Ⅰ組萎靡，且皮毛較暗淡。大鼠均于第14天采血后采用寰椎脫位法處死。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 三組大鼠血清IL-1、IL-6值

表2 三組大鼠血清TNF-α值

由表1、表2可見(jiàn)，染毒組及血必凈治療組IL-1、IL-6、TNF-α 濃度較空白組明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，說(shuō)明百草枯對(duì)大鼠機(jī)體造成了一定的炎性損傷;而血必凈治療組IL-1、IL-6、TNF-α濃度較染毒對(duì)照組明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，說(shuō)明血必凈注射液對(duì)急性百草枯中毒大鼠IL-1、IL-6、TNF-α有一定的抑制作用。

3 討論

目前，許多學(xué)者認(rèn)為，百草枯可以損傷內(nèi)皮細(xì)胞的活性和細(xì)胞膜的功能，這是百草枯引起肺纖維化的原因之一。Tsukamoto等［9-10］發(fā)現(xiàn)，百草枯處理過(guò)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞活力喪失、細(xì)胞膜功能發(fā)生障礙、NADPH減少、抗氧化防御系統(tǒng)酶活性增加，說(shuō)明百草枯直接破壞內(nèi)皮細(xì)胞，且與氧化應(yīng)激有關(guān)。同時(shí)，百草枯中毒后，肺部出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，包括肺泡巨噬細(xì)胞等;而肺泡巨噬細(xì)胞能合成釋放大量具有多種生物活性的細(xì)胞因子、前炎癥介質(zhì)、趨化因子及蛋白酶等，在肺炎、肺纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要意義［11］。百草枯對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞的毒性具有時(shí)間-劑量依賴性，肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)百草枯攝取與濃度呈線性關(guān)系，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)外濃度可達(dá)到平衡，百草枯是通過(guò)彌散作用進(jìn)入巨噬細(xì)胞的。另外，中性粒細(xì)胞一旦被激活，本身又將產(chǎn)生一系列的細(xì)胞因子和其他炎性介質(zhì)如中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(BALFNE)等，形成級(jí)聯(lián)放大網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致惡性循環(huán)，進(jìn)一步加重組織、器官損傷，其中肺纖維化是患者死亡的重要原因［12］。

血必凈注射液由中藥紅花、赤芍、川芎、丹參、當(dāng)歸、魚(yú)腥草等組成，具有活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)、潰散毒邪的作用，臨床上主要用于治療急危重癥如全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)及MODS等，其有效成分為紅花黃色素A、川芎嗪、丹參素、阿魏酸、芍藥苷、原兒茶醛等［13-14］。現(xiàn)代藥理證明，赤芍、丹參、紅花可以改善微循環(huán)，增加血流量;降低炎癥反應(yīng)以及毛細(xì)血管的通透性，減少炎性滲出，促進(jìn)炎癥吸收，抑制炎性肉芽腫形成，因而可以充分降低感染過(guò)程的病理?yè)p害;而且還可以增強(qiáng)RES的吸附功能以及白細(xì)胞的吞噬能力，使血腫以及其他壞死組織易被吞噬細(xì)胞吞噬吸收。川芎嗪可以直接改善紅細(xì)胞變形性，抑制血小板聚集，抑制TXB2的合成和釋放，促進(jìn)PGI2的合成。另外，川芎嗪還可以阻止缺氧時(shí)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，產(chǎn)生擴(kuò)血管作用［15］。

劉達(dá)興等［16］在對(duì)健康成年犬體外循環(huán)肺損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，血必凈注射液能減輕體外循環(huán)后血漿中TNF-α、IL-6和IL-8水平，對(duì)體外循環(huán)肺損傷有保護(hù)作用。孫元瑩等［17］發(fā)現(xiàn)，血必凈注射液能顯著抑制急性肺損傷大鼠TNF-α表達(dá)，對(duì)急性肺損傷具有良好的治療作用。在本實(shí)驗(yàn)研究中，血必凈治療組，大鼠血清中檢測(cè)TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá)水平都明顯低于染毒組，說(shuō)明血必凈有效地抑制了急性百草枯中毒引起的炎性反應(yīng)，減少了對(duì)機(jī)體的進(jìn)一步損傷。從而為百草枯中毒的救治提供有力的證據(jù)。

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